[發明專利]一種大豆PLP類酶及其編碼基因與應用

有效

• 申請號: 200910029450.2
• 申請日: 2009-04-14
• 公開（公告）號: CN101532005A
• 公開（公告）日: 2009-09-16
• 發明（設計）人: 喻德躍;寧慧霞;姚瑤
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C12N9/88
• 分類號: C12N9/88;C12N15/60;C12N15/63;C12N1/00;C12N1/21;C12N15/11;C12N15/82
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司
• 代理人: 張素卿

技術領域

本發明涉及植物基因工程領域。具體涉及與蛋氨酸合成相關的吡哆醛-5′-磷酸依賴碳-硫(C-S)裂解酶(pyridoxal-5′-phosphate-dependent?carbon-sulfur(C-S)lyase，PLP)及其編碼基因與應用，并涉及來源于大豆的與蛋氨酸合成相關的PLP類酶GmCBL及其編碼基因與其在培育高含量蛋氨酸植物品種中的應用。

背景技術

大豆[Glycine?max(L.)Merr.]是世界上主要的糧食和油料作物，是人類和動物食物中高質量植物蛋白質的主要來源。隨栽培條件和生長環境，大豆含有的蛋白質為30-55％，對大豆蛋白需求超過最一般的消費食物資源。但含硫半光氨酸和蛋氨酸含量少，是大豆蛋白質營養價值的限制因素，大豆蛋白中第一限制性氨基酸是蛋氨酸，其限制和降低了其它氨基酸的有效性。目前大豆蛋白質改良的最主要目標是提高蛋白質含量的同時，增加含硫氨基酸的即蛋氨酸(Met)的含量，以提高作為人蓄植物蛋白主要來源的大豆營養價值和經濟效益。利用基因工程手段改良大豆含硫氨基酸含量，有效的途徑之一是對涉及硫生物合成路徑中的關鍵酶進行操作。Cystathionine?β-lyase(CBL)(EC?4.4.1.8)，是PLP(pyridoxal-5′phosphate-dependent?carbon-sulfur(C-S)lyase)裂解酶類α家族內的γ亞家族，這個酶主要參與微生物和植物蛋氨酸生物合成的倒數第二步驟，其催化裂解L型-胱硫醚生成同型半胱氨酸，丙酮酸和NH₃。CBL酶是廣泛存在于植物、酵母、細菌以及真菌中。目前主要從大腸桿菌、擬南芥、馬鈴薯、水稻、菠菜等克隆出此基因。系統發育分析表明，CBL基因主要分為三種類型：單子葉植物、雙子葉植物和藻類植物。

蛋白資源短缺是21世紀面臨的全球性嚴重問題，尤其是發展中國家，因此盡快提高大豆品種蛋白質含量的同時，積極改善蛋白質的品質，提高其營養價值，對改善人類生活質量和畜牧產業具有積極而深遠的現實意義。

發明內容

技術問題

本發明的目的是提供一種大豆PLP類酶及其編碼基因與應用。

技術方案

本發明所提供的大豆PLP類酶，名稱為GmCBL，來源于大豆屬大豆[Glycinemax(L.)]，是具有序列表中的SEQ?ID?NO.2所述氨基酸序列的蛋白質。

上述的大豆PLP類酶的編碼基因，其cDNA基因具有序列表中GmCBL基因SEQID?NO.1的DNA序列；其中，序列表中的GmCBL基因SEQ?ID?NO.1由1404個脫氧核苷酸組成，本序列為GmCBL基因的讀碼框，編碼具有序列表中SEQ?ID?NO.2的氨基酸殘基序列的蛋白質。

含有本發明GmCBL基因SEQ?ID?NO.1的表達載體是指pMDC83-GmCBL植物過量表達載體，宿主菌是指將GmCBL基因轉入的根癌農桿菌菌株EHA105。

擴增GmCBL基因的引物是，

GmCBL?ORF正向引物：5‘-ATGTTTTCTTCTGCAATTT-3’，

GmCBL?ORF反向引物：5‘-AAGAGGCCCTGTTCTAAGT-3’。

上述大豆PLP類酶GmCBL酶及其編碼基因GmCBL基因可在培育高含量蛋氨酸植物中得到應用。

有益效果

導入過量表達GmCBL的煙草與未轉基因煙草相比，其蛋氨酸含量顯著提高，說明GmCBL基因對提高植物的蛋氨酸含量方面起著重要作用。

本發明的GmCBL對培育高含量蛋氨酸植物品種特別是高含量蛋氨酸大豆，提高農作物特別是大豆的品質具有重要意義。

利用植物表達載體，將本發明的GmCBL的編碼基因導入植物細胞，可獲得高含量蛋氨酸的轉基因細胞系及轉基因植株。

使用GmCBL構建植物表達載體時，在其轉錄起始核苷酸前可加上任何一種增強型啟動子或誘導型啟動子。為了便于對轉基因植物細胞或植物進行鑒定及篩選，可對所用植物表達載體進行加工，如加入可在植物中表達的選擇性標記基因(GUS基因、螢光素酶基因等)或具有抗性的抗生素標記物(慶大霉素標記物、卡那霉素標記物等)。從轉基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標記基因，直接以逆境篩選轉化植株。