[發明專利]具有高產α-環糊精能力的環糊精葡萄糖基轉移酶的突變體及突變方法

無效

• 申請號: 200910029154.2
• 申請日: 2009-01-06
• 公開（公告）號: CN101503681A
• 公開（公告）日: 2009-08-12
• 發明（設計）人: 吳敬;陳堅;李兆豐;張佳瑜
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N9/10
• 分類號: C12N9/10;C12N15/70;C12P19/34;C12R1/01
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所
• 代理人: 時旭丹;劉品超

技術領域

具有高產α-環糊精能力的環糊精葡萄糖基轉移酶的突變體及突變方法，本發明屬于基因工程和酶工程領域。具體地說本發明是利用蛋白質工程的定點突變方法改善環糊精葡萄糖基轉移酶(CGT酶)的產物特異性的技術。?

背景技術

環糊精是由六個以上葡萄糖連結而成的具有環狀疏水圓錐形結構的低聚糖非還原性化合物系列，其中最常用的是α-、β-、γ-環糊精，它們分別由6、7、8個葡萄糖單元構成。目前，環糊精的工業化生產均采用酶法合成，即在CGT酶催化作用下，通過環化反應轉化淀粉及相關基質合成環糊精。由于環糊精能與許多客體分子形成包合物，從而改變客體分子的物理和化學性質如溶解度、穩定性等，因此在食品、醫藥、農業等領域具有廣泛的應用。?

CGT酶是一個多功能型的酶，它能催化四種不同的反應：三種轉糖基化反應(歧化反應、環化反應和偶合反應)和水解反應。CGT酶通過環化反應能利用淀粉生產環糊精，這是其工業應用的基礎。用CGT酶生產環糊精一個主要的不利條件是所有已知的野生型CGT酶生產的是α-、β-、γ-環糊精的混合物。這不僅給產物的分離純化帶來很大不便，而且提高了生產成本。目前，兩種工藝可以用于從環糊精混合物中純化單一的環糊精：β-環糊精的選擇性結晶(β-環糊精溶解度相對低)和有機溶劑選擇性絡合。α-環糊精一般用癸醇，但這個化合物很難從水溶液中去除，因為其沸點高達229℃；一般用環十二酮對γ-環糊精進行絡合和選擇性沉淀，但是這個溶劑對于商業使用來講太貴，而且，有機溶劑使用的不利因素還包括它們的毒性和可燃性以及需要溶劑回收工藝，因此，目前α-、γ-環糊精的利用很大程度上受到限制。即使是β-環糊精的生產工藝也不是很理想，因為對于大多數應用來講，目前工藝使β-環糊精的生產成本還是太高。因此，如果所得到CGT酶所生產的環糊精中某一種特定的環糊精比例大大增高，那么就可以避免上述成本太高和有機溶劑污染等問題。?

本發明所使用的來源于Peanibacillus?macerans?JFB?05-01(CCTCC?NO：M208063)的CGT酶雖然在酶轉化反應初期主要生產α-環糊精，但后期α-環糊精的含量偏低，在未使用有機溶劑的情況下，反應混合液中β-環糊精的含量甚至高于α-環糊精，因此，進一步提高該酶的產α-環糊精能力對工業上α-環糊精的生產是相對有利的。?

發明內容?

本發明的一個目的是提供提高P.macerans?JFB?05-01?CGT酶產α-環糊精能力的突變方案。?

本發明的另一個目的是提出具有更高α-環糊精生產能力的突變體酶D372K，Y89D，Y89R及D372K/Y89R，及其構建方法。?

本發明的技術方案：?

來源于軟化類芽孢桿菌(Peanibacillus?macerans)JFB?05-01的環糊精葡萄糖基轉移酶，簡稱CGT酶，的三種單突變體酶D372K，Y89D及Y89R：將CGT酶基因中第372位的天冬氨酸Asp突變成了賴氨酸Lys，命名為D372K；將CGT酶基因中第89位的酪氨酸Tyr分別突變成了天冬氨酸Asp或精氨酸Arg，分別命名為Y89D及Y89R；它們相比于野生型CGT酶具有更高的產α-環糊精能力。?

三種單突變體酶D372K，Y89D及Y89R的制備方法，根據P.macerans?JFB05-01CGT酶基因序列，分別設計并合成引入D372K，Y89D或Y89R突變的引物，對CGT酶基因進行定點突變，測定DNA序列，分別鑒別出第372位Asp密碼子變成Lys密碼子，第89位Tyr密碼子分別變成Asp或Arg密碼子的突變體，并進行大腸桿菌表達。?

P.macerans?JFB?05-01?CGT酶的一種雙突變體酶D372K/Y89R：將單突變體酶D372K基因中第89位的酪氨酸Tyr突變成了精氨酸Arg，命名為D372K/Y89R，其相比于野生型CGT酶具有更高的產α-環糊精能力。?

一種雙突變體酶D372K/Y89R的制備方法，以單突變體酶D372K基因為模板，設計并合成引入Arg密碼子于89位的定點突變引物，對D372K基因進行定點突變，測定序列，鑒別出89位的Tyr突變成Arg的突變體，并進行大腸桿菌表達。?

所述的突變體酶D372K，Y89D，Y89R及D372K/Y89R的制備：?

(1)定點突變?

單突變體酶D372K，Y89D和Y89R的定點突變：利用快速PCR技術，以表達載體cgt/pET-20b(+)為模板，?

引入D372K密碼子的定點突變引物為：?