[發明專利]具有高產α-環糊精能力的環糊精葡萄糖基轉移酶的突變體及突變方法

無效

• 申請號: 200910029154.2
• 申請日: 2009-01-06
• 公開（公告）號: CN101503681A
• 公開（公告）日: 2009-08-12
• 發明（設計）人: 吳敬;陳堅;李兆豐;張佳瑜
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N9/10
• 分類號: C12N9/10;C12N15/70;C12P19/34;C12R1/01
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所
• 代理人: 時旭丹;劉品超

1.來源于軟化類芽孢桿菌(Peanibacillus?macerans)JFB?05-01的環糊精葡萄糖基轉移酶的單突變體酶D372K的制備方法，其特征是：

(1)定點突變

利用快速PCR技術，以表達載體cgt/pET-20b(+)為模板，

引入D372K密碼子的定點突變引物為：

正向引物：5’-GACCGGCGATGGCAAACCCAACAACC-3’，下劃線為突變堿基，

反向引物：5’-GGTTGTTGGGTTTGCCATCGCCGGTC-3’，下劃線為突變堿基，

PCR反應體系為：10×Ex?Taq?buffer?5μL，2.5mM?dNTPs?5μL，10μM正向引物1μL，10μM反向引物1μL，模板DNA?1μL，5U/μL?Ex?Taq?HS?0.25μL，加入雙蒸水至50μL；

PCR擴增條件為：94℃預變性4min；隨后進行94℃30s，55℃30s，72℃6min?35個循環；最后72℃保溫10min；

PCR產物經Dpn?I消化，轉化大腸桿菌JM109感受態細胞，感受態細胞在含100μg/mL氨芐青霉素的LB固體培養基培養過夜后，挑單克隆于含100μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養基中培養，后提取質粒，將突變質粒轉化表達宿主大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞，突變質粒測序正確；

(2)突變體的表達與純化：

挑取轉入表達宿主大腸桿菌BL21(DE3)的單克隆于含100μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養基生長8～10h，按4％接種量將種子發酵液接到含100μg/mL氨芐青霉素的TB液體培養基；大腸桿菌在30℃搖床培養至OD₆₀₀＝0.6，加入0.01mM終濃度的IPTG誘導胞外表達，并在25℃搖床繼續培養發酵90小時后，將發酵液于4℃、10000rpm離心20min除菌體，收集上清液并純化，得到突變體酶D372K制品。

2.來源于軟化類芽孢桿菌(Peanibacillus?macerans)JFB?05-01的環糊精葡萄糖基轉移酶的單突變體酶Y89D的制備方法，其特征是：

(1)定點突變

利用快速PCR技術，以表達載體cgt/pET-20b(+)為模板，

引入Y89D密碼子的定點突變引物為：

正向引物：5’-CTCCGTCATCAAGGATTCCGGCGTTA-3’，下劃線為突變堿基，

反向引物：5’-TAACGCCGGAATCCTTGATGACGGAG-3’，下劃線為突變堿基，

PCR反應體系為：10×Ex?Taq?buffer?5μL，2.5mM?dNTPs?5μL，10μμM正向引物1μL，10μM反向引物1μL，模板DNA?1μL，5U/μL?Ex?Taq?HS?0.25μL，加入雙蒸水至50μL；

PCR擴增條件為：94℃預變性4min；隨后進行94℃30s，55℃30s，72℃6min?35個循環；最后72℃保溫10min；

PCR產物經Dpn?I消化，轉化大腸桿菌JM109感受態細胞，感受態細胞在含100μg/mL氨芐青霉素的LB固體培養基培養過夜后，挑單克隆于含100μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養基中培養，后提取質粒，將突變質粒轉化表達宿主大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞，突變質粒測序正確；

(2)突變體的表達與純化：

挑取轉入表達宿主大腸桿菌BL21(DE3)的單克隆于含100μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養基生長8～10h，按4％接種量將種子發酵液接到含100μg/mL氨芐青霉素的TB液體培養基；大腸桿菌在30℃搖床培養至OD₆₀₀＝0.6，加入0.01mM終濃度的IPTG誘導胞外表達，并在25℃搖床繼續培養發酵90小時后，將發酵液于4℃、10000rpm離心20min除菌體，收集上清液并純化，得到突變體酶Y89D制品。