[發明專利]恩諾沙星單克隆抗體及應用

有效

• 申請號: 200910027793.5
• 申請日: 2009-05-21
• 公開（公告）號: CN101565690A
• 公開（公告）日: 2009-10-28
• 發明（設計）人: 唐宏;王曉艷
• 申請（專利權）人: 泰州市蛋白質工程研究院
• 主分類號: C12N5/20
• 分類號: C12N5/20;C07K16/44;C12N15/06;C12P21/08;G01N33/577
• 代理公司: 南京蘇科專利代理有限責任公司
• 代理人: 何朝旭

技術領域

本發明涉及恩諾沙星的特異性單克隆抗體及其制備方法和應用，還涉及其雜交瘤細胞株，屬于免疫化學技術領域。

背景技術

恩諾沙星(enrofloxacin)是第一個畜禽專用的氟喹諾酮類藥物，因其具有抗菌譜廣、抗菌活性強、易吸收、體內分布廣等優點而被廣泛應用于獸醫臨床預防和治療。隨著該藥物在食源性動物中的廣泛應用，由其引起的毒副作用如神經中毒、腎功能損傷、過敏反應、幼畜關節炎等也日益增多。由于該藥物在動物性食品中的殘留而誘導人類致病菌產生耐藥性問題的發現，進一步加深了人們對該藥的認識。為了減少該藥物對人類的危害，美國禁止將恩諾沙星用于食品動物，而日本厚生勞動省自2007年5月將魚、貝類產品中恩諾沙星的殘留限量由0.1ppm調整為0.01ppm。因此，開展其殘留檢測方法的研究至關重要。為了監控恩諾沙星在動物性食品中的殘留，聯合國糧農組織(FAO)/世界衛生組織(WHO)和食品添加劑聯合專家委員會(JCEFA)制定了恩諾沙星在牛、豬、禽的最高殘留限量(maximum?residue?limit，MRL)。美國FDA規定恩諾沙星禁用于食品動物，歐盟(EC)規定恩諾沙星在牛、豬、家禽的肝、腎、肌肉中最高殘留限量(MRL)為30μg/kg；世界衛生組織(WHO)推薦的恩諾沙星MRL為40μg/kg。我國農業部規定恩諾沙星在肌肉、牛奶中的MRL不得超過100μg/kg。因此加強對該藥在動物性食品中的殘留檢測和監督顯得尤為突出。然而作為半抗原的恩諾沙星本身不能誘導機體產生抗體，必須將其與載體蛋白偶聯獲得人工合成的完全抗原才具有抗原性。而小分子抗原與載體蛋白的偶聯效果及細胞融合后陽性克隆的篩選都直接影響著抗體的制備效果，是抗體制備的關鍵。為了建立恩諾沙星酶免疫分析方法和金標試紙，需要制備特異性強、可大量生產的抗恩諾沙星的單克隆抗體。

申請人檢索發現中國農業科學(2004，37(7)：1?060-1?064)的一篇文獻中介紹了恩諾沙星單克隆抗體的制備及其鑒定，主要是用碳二亞胺法合成了2種恩諾沙星(enrofloxacin，ENFX)人工抗原ENFX-BSA和ENFX-OVA，用紫外掃描和分析載體蛋白的氨基酸組成等方法對人工抗原進行鑒定，ENFX與BSA的結合比約為48∶1。用ENFX-BSA免疫BALB/C小鼠，采用顯微克隆技術最終篩選出2株特異性分泌細胞2C5和5D5并獲取腹水，純化后腹水效價分別為1∶3200和1∶6?400。2C5和5D5均屬IgG2a型抗體。該單抗對氟喹諾酮類藥物有很高的選擇性，與環丙沙星、麻保沙星、沙拉沙星、達氟沙星的交叉反應率分別為110.84％、27.40％、71.05％和37.41％，交叉反應率比較高，特異性不強。

發明內容

本發明的目的是：針對以上現有技術存在的缺點，提出與環丙沙星和沙拉沙星無交叉反應的，并具有特異性的、可大量生產的恩諾沙星單克隆抗體。

本發明的另一個目的是提供分泌該特異性抗恩諾沙星單克隆抗體的雜交瘤細胞株。

本發明的目的是通過以下技術方案實現的：

本發明產生恩諾沙星單克隆抗體的雜交瘤細胞株6A4或8E6，6A4是小鼠雜交瘤細胞系CGMCC?No.3016，于2009年4月9日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號是：CGMCCNo.3016；8E6是小鼠雜交瘤細胞系CGMCC?No.3017，于2009年4月9日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號是：CGMCC?No.3017。

由小鼠雜交瘤細胞株6A4或小鼠雜交瘤細胞株8E6分泌的單克隆抗體。

小鼠雜交瘤細胞株6A4或小鼠雜交瘤細胞株8E6分泌的單克隆抗體的的制備方法，包括以下步驟：

a.制備免疫原和包被原：采用碳二亞胺法將載體蛋白與恩諾沙星偶聯，合成免疫原和包被原；

b.動物免疫注射：以小鼠作為免疫動物，腹腔注射免疫原與等量弗氏完全佐劑混合液，進行第一次免疫注射；3周后進行第二次免疫注射；再間隔2周后進行第三次免疫注射；

c.篩選動物免疫血清：用酶聯免疫吸附法和競爭酶聯免疫吸附法篩選免疫鼠血清，對小鼠進行加強免疫注射；

d.制備雜交瘤細胞：取經過加強免疫的小鼠的脾細胞與骨髓瘤細胞進行細胞融合，經過3次亞克隆獲得穩定分泌抗恩諾沙星的單克隆抗體細胞株6A4或8E6；

e.制備并純化單克隆抗體：用滅菌石蠟對小鼠進行免疫，7天后分別腹腔注射所述單克隆抗體細胞株6A4或8E6，7-10天采集腹水，用辛酸-硫酸銨鹽析法對腹水純化，即得恩諾沙星單克隆抗體。