[發明專利]一種快速檢測藻毒素的免疫磁珠層析試紙條及其制備方法

無效

• 申請號: 200910027457.0
• 申請日: 2009-05-07
• 公開（公告）號: CN101551390A
• 公開（公告）日: 2009-10-07
• 發明（設計）人: 胥傳來;李灼坤;徐麗廣;劉麗強
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: G01N33/552
• 分類號: G01N33/552;G01N33/558;G01N33/531;G01N33/532
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所
• 代理人: 時旭丹;劉品超

1、一種藻毒素免疫磁珠層析檢測試紙條，其特征是由襯板和在襯板上依次銜接的樣品墊、磁標結合墊、包被膜、吸水墊組成，磁標結合墊為吸附藻毒素磁標抗體的玻璃纖維棉，在包被膜上有用藻毒素偶聯的載體蛋白溶液印制的直線式隱形檢測線T線，用羊抗兔IgG溶液印制的直線式隱形對照線C線；

所述的襯板為不吸水的硬質塑膠條或硬紙條；樣品墊為玻璃纖維棉、尼龍膜、聚偏二氟乙烯膜、或聚酯膜；包被膜為硝酸纖維素膜、純纖維素膜、或羧化纖維素膜；吸水墊為吸水濾紙或濾油紙；

所述的藻毒素磁標抗體為磁珠標記的藻毒素的多克隆抗體；

所述的磁珠為表面修飾有羧基的Fe₃O₄磁珠；

所述的偶聯藻毒素的載體蛋白為：牛血清白蛋白BSA、雞卵清白蛋白OVA。

2、權利要求1所述藻毒素免疫磁珠層析檢測試紙條的制備方法，其特征是

1)藻毒素全抗原的合成及鑒定：用碳化二亞胺法分別將BSA，OVA與藻毒素MC-LR進行偶聯，得到藻毒素的全抗原MC-LR-BSA以及MC-LR-OVA，并利用紫外掃描儀進行鑒定；

2)多克隆抗體的制備與純化：以MC-LR-BSA作為免疫原，免疫新西蘭兔，按常規方法制備多克隆抗體并以硫酸銨純化；

3)免疫磁珠的制備：將MC-LR抗體與帶羧基的納米磁珠偶聯，制備含MC-LR抗體的免疫磁珠，即藻毒素磁標抗體；以玻璃纖維棉吸附藻毒素磁標抗體制備磁標結合墊；

4)包埋MC-LR-OVA和羊抗兔IgG至硝酸纖維素膜：用噴膜儀將選定濃度的包被原MC-LR-OVA以及羊抗兔IgG分別噴載于包被膜的T線和C線上，37℃烘箱干燥10min備用；

5)檢測試紙條的制作：將樣品墊、磁標MC-LR抗體的結合墊、包埋包被原MC-LR-OVA和羊抗兔IgG的包被膜、吸水墊依次銜接在襯板上，組成藻毒素免疫磁珠層析檢測試紙條；

6)樣品檢測：將試紙條樣品墊插入待測樣品溶液，樣品溶液將通過層析作用從試紙條上從下而上流過，10～20秒后取出試紙條，再于室溫下反應15分鐘后，將測試板放入Enviso^TM?System的Magnetic?Assay?Reader進行檢測，此檢測儀器將已經轉化成磁場信號的生物學反應信號進一步以電信號方式輸出；繪制標準曲線后，依據標準曲線求出待測樣品的藻毒素含量。

3、根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于所述的免疫磁珠的制備：將多克隆MC-LR抗體與納米磁珠偶聯，制備含MC-LR抗體的免疫磁珠：吸取適量磁珠至小試管中，離心使磁珠與貯存液分離，去除貯存液并加入乙磺酸MES清洗緩沖液渦旋和超聲清洗并離心，重復幾次，最后重懸磁珠，將一定體積的新鮮配置的水溶性碳化二亞胺EDC和N-羥基琥珀酰亞胺NHS加入磁珠懸液中活化羧基，使磁珠表面羧基與EDC和NHS的摩爾比為1∶4∶3，渦旋混合后于室溫低速攪拌孵育反應2小時，分別用MES清洗緩沖液及硼酸清洗緩沖液清洗磁珠，隨后將MC-LR抗體緩慢滴加入磁珠懸液中低速攪拌孵育反應過夜，再逐滴加入質量濃度5％BSA，使BSA的終濃度為1％，持續攪拌5min，以飽和游離的磁珠，低速離心去除凝聚的磁珠沉淀，然后再用硼酸清洗緩沖液清洗磁珠去除未結合的蛋白質，將磁珠轉移至新管，棄掉硼酸清洗緩沖液，并用偶聯緩沖液重懸浮，放4℃冰箱存放，用定量加樣裝置將已經標記有MC-LR抗體的磁珠加入磁標結合墊，并放入37℃烘箱干燥10min備用組成檢測試紙條。