[發(fā)明專利]一種對禽類精原干細胞進行基因打靶的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200910025879.4
• 申請日: 2009-03-12
• 公開（公告）號: CN101575614A
• 公開（公告）日: 2009-11-11
• 發(fā)明（設計）人: 徐世永;劉紅林
• 申請（專利權）人: 金陵科技學院;劉紅林;徐世永
• 主分類號: C12N15/861
• 分類號: C12N15/861;C12R1/93
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙)
• 代理人: 肖明芳

1.一種對禽類精原干細胞進行基因打靶的方法，其特征在于該方法的步驟為：

(1)禽類腺相關病毒的基因轉移載體pAAAV-TR質粒的構建；

(2)pMD19-2HS4質粒的構建；

(3)雞卵清蛋白基因全序列擴增；

(4)將以步驟(3)擴增出的雞卵清蛋白基因全序列為模板擴增出的同源臂HA1和HA2、與以步驟(2)構建的pMD19-2HS4質粒為模板擴增出的2HS4，及正選抗性基因表達組件，進行PCR拼接；

(5)將步驟(1)構建的禽類腺相關病毒的基因轉移載體與步驟(4)拼接出的產物連接，構建出雞卵清蛋白基因打靶載體；

(6)pAAAV-RC質粒的構建；

(7)利用步驟(5)得到的雞卵清蛋白基因打靶載體和步驟(6)得到的pAAAV-RC質粒生產重組病毒；

(8)雞精原干細胞的分離培養(yǎng)；

(9)利用步驟(7)得到的重組病毒感染步驟(8)得到的精原干細胞；

其中，步驟(1)所述的禽類腺相關病毒的基因轉移載體的構建方法為：禽類腺相關病毒的基因轉移載體的基本骨架由pTRE-tight-B1質粒經PCR擴增獲得；病毒5′、3′LTR根據GenBank公布的禽類腺相關病毒序列AY186198，由人工分段合成；用連接試劑盒分別連接載體基本骨架與合成好的病毒5′及3′LTR，構建出pAAAV-TR質粒；

步驟(2)所述的pMD19-2HS4質粒的構建方法為：根據GenBank中公布的雞HS4序列GenBank?NW_001471556?293787-294082設計出引物，以雞基因組DNA為模板，進行PCR反應；將PCR產物TA克隆進入pMD19-T載體即構建出pMD19-HS4質粒；取兩份pMD19-HS4質粒，一份以Bcl?I、HindIII雙酶切，取短片段，一份以BglII、HindIII雙酶切，取長片段，將兩片段以PCR清潔試劑盒純化回收后以快速連接試劑盒進行連接，構建出質粒pMD19-2HS4；

步驟(6)所述的pAAAV-RC質粒的構建方法為：根據GenBank?AY186198序列人工合成禽類腺相關病毒rep、cap基因，范圍從238-4488bp，合成時在5′端加入一個Bgl?II酶切位點，3′端加入一個Not?I酶切位點；取pEGFP質粒及人工合成序列，分別以BglII、Not?I雙酶切，然后以快速連接試劑盒進行連接，轉化JM109感受態(tài)細菌進行擴增鑒定，構建出質粒pAAAV-RC。

2.根據權利要求1所述的對禽類精原干細胞進行基因打靶的方法，其特征在于步驟(7)所述的利用步驟(5)得到的雞卵清蛋白基因打靶載體和步驟(6)得到的pAAAV-RC質粒生產重組病毒，方法如下：取雞卵清蛋白基因打靶載體、pAAAV-RC質粒和pHelper在無血清培養(yǎng)基條件下轉染細胞AAV-293；兩天后取細胞，經重懸、凍融處理后，細胞裂解物經離心取上清，即為重組病毒懸液。