[發明專利]腸道病毒EV71檢測特異性引物和探針

有效

• 申請號: 200910024427.4
• 申請日: 2009-02-24
• 公開（公告）號: CN101812535A
• 公開（公告）日: 2010-08-25
• 發明（設計）人: 李楊霞;楊英;符芳芳
• 申請（專利權）人: 江蘇默樂生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 泰州地益專利事務所 32108
• 代理人: 王楚云

技術領域

本發明是一種用于檢測腸道病毒EV71核苷酸序列的特異性引物和探針。

背景技術

人腸道病毒71型(EV71)屬于腸道病毒(Enteroviruses，EVs)，微小核糖核酸病毒科， 其核酸為單股正旋RNA，其衣殼蛋白由VP1、VP2、VP3和VP4四種結構組成。EV71感染 常引起患者手足口病，并可造成嚴重的神經系統疾病，同時，有關于其引起神經性肺水腫的 報道。自1969年首自從加利福尼亞一患者糞便中分離出后，如今，EV71已蔓延至全世界， 嚴重威脅人類，尤其是嬰幼兒的健康與生命，并引起了多次爆發與流行，導致社會恐慌。由于 目前尚無有效的針對EV71的疫苗，因此，及時診斷疾病、處理疫情十分重要，而這就需要 一種既能準確又快速的實驗室檢驗方法來確定病原，這也是臨床診斷與流行病學研究的一個 必不可少的環節。

腸道病毒EV71的檢測技術包括有病毒分離、血清免疫學、以PCR為基礎的分子生物學 和免疫組化等方法。病毒分離方法繁瑣，周期長，而且，有可能會得不到合適的臨床標本或 無法分離到病毒株。使用血清型特異性的中和抗血清進行的中和實驗可用于進行腸道病毒的 鑒定，試驗結果可靠性不是很高，并且由于腸道病毒包括若干個血清型，通常要使用組合抗 血清進行鑒定。PCR檢測法簡便、快速，近年來，在臨床檢測中備受青睞，但是，普通PCR 檢測易產生污染。實時熒光定量PCR方法因其特異、靈敏且準確等優點，在人類傳染病和病 原定量上的應用日益廣泛。在實時熒光定量PCR檢測方法中，引物和探針的設計尤為重要， 決定了檢測結果的有效性。

發明內容

本發明的目的在于提供一種用于檢測腸道病毒EV71的特異性引物和探針。

基于上述目的，本發明采用以下技術方案。

用于檢測腸道病毒EV71的特異性引物和探針序列包括：上游引物VP1F序列為5’CAY GTC?AGR?GCD?TGG?RTH?CC?3’，下游引物VP1R序列為5’KYR?TAR?TTY?GGR?TTG?GYY TTR?AAC?A?3’和探針VP1P序列為5’FAM?CGC?CCG?ATG?CGY?AAC?CAAAA?TAMRA?3’。

本發明的具體原理是利用一對靶核酸序列的特異性引物和探針，采用一步法實時熒光定 量RT-PCR試劑盒，通過PCR技術實現靶核酸序列片斷的擴增。所使用的探針為兩端分別標 記熒光報告基團(R)和熒光淬滅基團(Q)的寡核苷酸。在探針完整時，報告基團發出的熒 光被淬滅基團吸收，在PCR擴增過程中，DNA聚合酶的5’端外切酶活性將特異結合在靶核 苷酸片斷上的熒光探針酶切降解，使報告基團的熒光信號可以被檢測，熒光信號量的變化與 擴增產物量成正比，從而可以通過熒光強弱來判斷待測樣本中靶核苷酸序列的存在。

附圖說明

利用引物對VP1F/VP1R和探針VPIP檢測腸道病毒EV71陽性樣本的熒光PCR擴增圖。 見附圖1。

具體實施方式

1.引物和探針的設計：通過分別對所有已知的腸道病毒EV71型VP1基因序列進行比較 分析，選擇高度保守的區段，設計多對引物和探針，引物長度一般為20堿基左右。最優引物 探針序列組合如下：

上游引物VP1F：5’CAY?GTC?AGR?GCD?TGG?RTH?CC?3’

下游引物VP1R：5’KYR?TAR?TTY?GGR?TTG?GYY?TTR?AACA?3’

探針VP1P：5’FAM?CGC?CCG?ATG?CGY?AAC?CAAAA?TAMRA?3’。

2.反應體系的優化：利用滅活的腸道病毒EV71作為待檢樣品，用Trizol試劑抽提病毒 基因組RNA，分裝后貯存于-80℃。

2.1引物濃度的優化在反應體系中其它條件相同的情況下，將EV71引物濃度分別從0.1 μmol/l至1.6μmol/l作倍比連續稀釋，通過對試驗結果的分析比較，確定最佳引物濃度是0.2 μmol/l。

2.2探針濃度的優化在反應體系中其它條件相同的情況下，將EV71探針濃度分別從 0.1μmol/l至0.5μmol/l作倍比連續稀釋，通過對試驗結果的分析比較，確定最佳探針濃度是 0.16μmol/l。