[發明專利]一種腺病毒載體介導的立體狀態牙胚成釉細胞基因轉染方法

無效

• 申請號: 200910022995.0
• 申請日: 2009-06-19
• 公開（公告）號: CN101586121A
• 公開（公告）日: 2009-11-25
• 發明（設計）人: 段小紅;毛勇
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第四軍醫大學
• 主分類號: C12N15/861
• 分類號: C12N15/861
• 代理公司: 西安通大專利代理有限責任公司
• 代理人: 陸萬壽

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及牙胚的基因轉染及成釉細胞的基因功能研究，特別涉及一種腺病毒載體介導的立體狀態牙胚成釉細胞基因轉染方法。

背景技術

基因轉染是將外源性基因片段轉入到宿主細胞表達，是研究基因功能的重要方法之一，以單層培養細胞作為宿主細胞的基因轉染來研究其基因功能已得到廣泛應用。腺病毒載體是目前表達載體較為常用的一種，通常重組的腺病毒載體包括復制缺陷型和增殖型兩種；而且通過腺病毒載體的介導能夠將一些外源性的基因導入一般表達載體較難導入的組織或細胞，如視網膜、呼吸上皮、胎盤和粘膜下腺等(Ehrengruber?MU，Hennou?S，Bueler?H，NaimHY，Deglon?N，Lundstrom?K.Gene?Transfer?into?Neurons?from?HippocampalSlices：Comparison?of?Recombinant?Semliki?Forest?Virus，，Adenovirus，Adeno-Associated?Virus，Lentivirus，and?Measles?Virus.Molecular?and?CellularNeuroscience?2001?May；17(5)：855-71；Takahashi?M，Delivery?of?genes?to?the?eyeusing?lentiviral?vectors，Methods?Mol?Biol?2004，46：439-49.)。同時腺病毒(AAV)在基因治療方面也體現出了安全、長效等特征。

AAV-GFP表達載體是一種包含綠色熒光標記GFP基因的常用腺病毒表達載體(McCarty，D.M.，Christensen，M.，Muzyczka，N.，1991.Sequences?requiredfor?coordinate?induction?of?adeno-associated?virus?p19?and?p40?promoters?by?Repprotein.J.Virol.65，2936～2945；Zolotukhin，S.，Potter，M.，Hauswirth，W.W.，Guy，J.，Muzyczka，N.，1996.A“humanized”green?fluorescent?protein?cDNA?adapted?forhigh-level?expression?in?mammalian?cells.J.Virol.70，4646～C4654)，利用AAV-GFP表達載體轉染人胚腎AAV-293細胞，得到具有傳染性的病毒顆粒。

牙胚是一個特殊的器官，可以發育最終形成未來的牙齒。牙胚的發生和發育包括牙板、蕾狀期、帽狀期和鐘狀期等，既有一定的獨立性，又于周圍組織存在一定的互動，牙胚內上皮和間充質來源的兩種組織相互影響彼此的發生。成釉細胞是分泌牙釉質基質的一種上皮細胞，出現于鐘狀期牙胚，位于成釉器之中，表現為一均勻分布的細胞層，當其分泌牙釉質基質蛋白結束后，細胞會逐步退化消失。成釉細胞與周圍的組織和細胞接觸緊密，無法徹底分離。

目前有一些適合于牙胚體外培養的模型，這些模型采用立體培養牙胚的方法，包括采用瓊脂基質、濾膜、Trowell系統等(Onishi?T，Shintani?S，WakisakaS，Ooshima?T.Relationship?of?vitamin?D?with?calbindin?D9k?and?D28kexpression?in?ameloblasts，Arch?Oral?Biol?2008?February，53(2)：117-23；Torres-Quintana?MA，Lecolle?S，Goldberg?M.Effects?of?inositol?hexasulphate，a?casein?kinase?inhibitor，on?dentine?phosphorylated?proteins?in?organ?culture?ofmouse?tooth?germs.Arch?Oral?Biol?1998?August，43(8)：597-610)。