[發明專利]一種用于預防煙草花葉病毒病的小干擾RNA的制備和應用

無效

• 申請號: 200910022200.6
• 申請日: 2009-04-27
• 公開（公告）號: CN101570752A
• 公開（公告）日: 2009-11-04
• 發明（設計）人: 安德榮;趙明敏;張文斌
• 申請（專利權）人: 西北農林科技大學
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/10;C12N15/70;C12N15/74;A01N63/02;A01P1/00;C12R1/01;C12R1/19
• 代理公司: 西安新思維專利商標事務所有限公司
• 代理人: 韓 翎

一、技術領域：

本發明涉及一種用于預防煙草花葉病毒(Tobacco?Masaic?Virus-TMV)感染的新型生物制劑，尤其是涉及一種用于預防煙草花葉病毒病的小干擾RNA(small?interfering?RNA-siRNA)的制備，屬于生物制藥技術領域。

二、背景技術：

RNA干擾現象是指當與內源性mRNA編碼區某段序列同源的雙鏈RNA(dsRNA)導入細胞后，該mRNA發生特異性的降解，而導致該基因表達的沉默。是屬于轉錄后基因沉默(posttranscriptional?gene?silencing，PTGS)機制范疇，被認為是植物在進化過程中發展出的一種非常先進的抵抗外來基因(病毒、轉座子等)入侵的防御方式。目前，在果蠅(Drosophila)、錐蟲(Trypanosomes)、渦蟲(Planaria)、斑馬魚(Zebrafish)、擬南芥(Arabid?opsis?thaliana)、大小鼠和人體內均發現了RNAi現象。在RNA干擾應用方面，21nt的小干擾RNA作為RNAi途徑的重要中介，已被廣泛應用于哺乳動物和人細胞體系中基因功能和抗病毒研究，并取得了良好效果，但在植物抗病毒研究中應用較少。

根癌農桿菌介導的瞬時表達系統已廣泛用于非轉基因植物的基因功能研究，它不僅可以快速地導入外源基因，而且使轉入基因在短時間內表達。它的另一個特點是可以在一個葉片組織中同時導入多個基因。由于上述優點，這一研究技術將在功能基因組學和蛋白組學研究中發揮更大的作用。

煙草花葉病毒具有寄主范圍廣、抗逆性強和在生產上造成的危害大等特點。TMV可侵染茄科、藜科、莧科、葫蘆科、十字花科、木犀科、錦葵科、番杏科、豆科和商陸科等共30科300多種植物，包括煙草、番茄、茄子、辣椒、菠菜等。全世界每年因TMV而造成的經濟損失就超過1億美元；在我國，南北煙區均有發生，尤其南方煙區受害較重，田間株發病率一般5％～20％，個別田塊可高達30％～100％，早期發病的損失可達50％～70％，甚至失收；此外，染病煙葉的質量等級也會下降，品質變劣，對優質煙葉生產構成了極大威脅。同時TMV體外失活溫度較高，汁液中的病毒經75℃處理40d才失去致病力，干病葉在120℃經30min仍不失致病力，防治相當困難。

另一方面，煙草花葉病毒是正單鏈RNA病毒，是典型的模式植物病毒。該病毒基因組中，126kDa蛋白是病毒的復制酶，參與TMV病毒在植物體內的復制和增殖；外殼蛋白具有保護病毒RNA，病毒在植物體內的長距離運輸，參與黃化癥狀的表達；30kDa的運動蛋白與病毒在細胞與細胞間的運動有關。研究清楚RNA干擾在植物抗TMV上的作用，既可防治由煙草花葉病毒引起多種植物病毒病，如煙草花葉病，辣椒病毒病，番茄病毒病。可以帶動其他病毒的相關理論問題和應用實踐研究。

三、發明內容：

本發明為了解決上述背景技術中的不足之處，提供一種用于預防煙草花葉病毒病的小干擾RNA及制備和應用，其能有效干擾煙草花葉病毒的侵染，預防由煙草花葉病毒引起多種植物病毒病。

為實現上述目的，本發明采用的技術方案為：

一種用于預防煙草花葉病毒病的小干擾RNA的制備，其特征在于：小干擾RNA的核苷酸序列為：

(1)相應于TMV復制酶基因ORF1519-1537、2129-2147片段的19寡核苷酸序列：

siRNA1519：

F：5’-GATCCAAGCTTCGACTTATCAGAGTGGCAGGCTTCAAGAGAGCCTGCCACTCTGATAAGTTTTTTTGAGCT-3’

R：5’-CAAAAAACTTATCAGAGTGGCAGGCTCTCTTGAAGCCTGCCACTCTGATAAGTCGAAGCTTG-3’

siRNA2129：

F：5’-GCTGGATCCAAGCTTCGTTCGTAAGCAGATGAGCTCTTCAAGAGAGAGCTCATCTGCTTACGAATTTTTGAGCTCCTG-3’