[發(fā)明專利]紅曲米固態(tài)發(fā)酵生產凝乳酶的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200910020236.0
• 申請日: 2009-03-30
• 公開（公告）號: CN101514336A
• 公開（公告）日: 2009-08-26
• 發(fā)明（設計）人: 王成忠;于功明;顧振磊
• 申請（專利權）人: 山東輕工業(yè)學院
• 主分類號: C12N9/64
• 分類號: C12N9/64;C12R1/66
• 代理公司: 濟南金迪知識產權代理有限公司
• 代理人: 周慰曾

【技術領域】

本發(fā)明屬于生物制劑制備技術領域，涉及紅曲米固態(tài)發(fā)酵生產凝乳酶的方法。

【背景技術】

凝乳酶是乳酪制造業(yè)的一種重要酶制劑，可以使牛奶凝固。主要是從未斷奶的小牛胃中提取，其成分為一種天門冬氨酸蛋白酶。隨著乳酪生產逐年增加的需要，凝乳酶的需求量也越來越大，其產值占全世界酶制劑的15％左右。全球每年屠宰小牛5000多萬頭，小牛的數量急劇減少。乳酪在我國產量很少，而在發(fā)達國家將近1/3～1/2的原料乳用于乳酪生產，品種多達數百種，國內外生產差距十分巨大。乳酪盡管在短期內不會成為我國乳制品的主要品種，但從長遠看，特別是在經濟全球化的大背景下，這一產品必將成為未來國內乳品工業(yè)的重要產品之一，對凝乳酶的研究有著廣闊的市場前景。

微生物凝乳酶在干酪生產中的應用效果已有報道。與標準凝乳酶相比，在乳成分利用率、蛋白水解率以及干酪出品率和感官質量等方面均無明顯差別。報道稱用從大腸桿菌中生產的重組凝乳酶在凝乳時間、凝乳質地、排乳清及酸化、蛋白分解、干酪成熟、最終成分和干酪產量以及干酪感官質量方面與小牛凝乳酶相比無明顯差別。這說明利用微生物技術生產的凝乳酶完全可以替代從小牛皺胃中提取的天然凝乳酶。

紅曲米異名：紅曲；赤曲；紅米；福米。性質：為棕紅色至紫紅色的米粒。來源：以秈稻、粳稻、糯米等稻米為原料，用紅曲霉菌發(fā)酵而成，為棕紅色或紫紅色米粒。紅曲米是中國獨特的傳統(tǒng)食品，距今已經有千年歷史。

紅曲米發(fā)酵液作為凝乳劑是發(fā)酵液中的凝乳酶在發(fā)揮作用，紅曲米發(fā)酵液中的凝乳酶其實是紅曲米發(fā)酵液中微生物代謝產物，屬于微生物源凝乳酶，由于紅曲米是我國傳統(tǒng)的食品添加劑，所以從紅曲米發(fā)酵液中凝乳酶無需考慮微生物所產的非酶類代謝產物。

【發(fā)明內容】

針對現有技術的不足，本發(fā)明提供一種紅曲米固態(tài)發(fā)酵生產凝乳酶的方法。

本發(fā)明的技術方案如下：

一種紅曲米固態(tài)發(fā)酵制備凝乳酶的方法，步驟如下：

1)紅曲米粉碎成粉狀，細度200-400目，將紅曲米粉接種到固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基上，28-30℃恒溫培養(yǎng)90-96h。紅曲米粉與固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的質量比1∶100-1∶150

2)向上述培養(yǎng)物中加入蒸餾水，蒸餾水體積是培養(yǎng)物體積的2-2.5倍，抽濾，取濾液，旋轉蒸發(fā)儀濃縮至原體積1/3-1/4，得凝乳酶溶液。

3)向上述凝乳酶溶液加入乙醇進行醇沉兩次，兩次醇沉中使用的乙醇體積均是凝乳酶溶液體積的2-3倍，4-6℃低溫離心，冷凍升華干燥，即為凝乳酶粗酶。

4)將上述步驟3)得到的凝乳酶粗酶溶于pH為6.2的磷酸緩沖液中，即為凝乳酶粗液。

5)使用Sephadex?G-75凝膠柱層析純化凝乳酶粗液，以pH6.2的磷酸緩沖液作為洗脫液，分步收集，檢驗收集液的活性，合并有活性的洗脫液。

6)利用DEAE-纖維素52對上述洗脫液進一步純化，以pH7.2的磷酸鹽緩沖液為起始緩沖液，采用NaCl梯度洗脫，分步收集，檢測活性，合并有活性洗脫液，濃縮凍干得到高純度的凝乳酶。

上述步驟1)中的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基是：(按干物質的質量百分比)麩皮40％-50％和豆粕50％-60％，加入麩皮與豆粕總質量0.5％-1％的葡萄糖，加水使固液比1∶1.5-1∶2質量比。

上述步驟3)中第一次醇沉中使用的乙醇濃度為72％wt，第二次醇沉中使用的乙醇濃度為95％wt。

上述步驟6)中所述利用NaCl梯度洗脫優(yōu)選0.15mol/L、0.25mol/L、0.35mol/L、0.45mol/L和0.55mol/L?NaCl濃度的緩沖液進行梯度洗脫。

本發(fā)明方法中涉及的各種原料均可市場購得。發(fā)酵殘渣的處理簡單，經過高溫殺菌后，可作為高級動物飼料。

本發(fā)明所得凝乳酶活力4300U/mg以上。

凝乳酶活力測定方法：利用Arima法，取5mL質量濃度為100g/L的脫脂乳溶液，40℃保溫5min，備用。取0.5mL處理后的酶液加入保溫的脫脂乳液，旋渦混合器上混合，準確記錄從加入酶液到乳凝固的時間。

酶單位定義為：40min將1mL質量濃度為100g/L的脫脂乳凝固的酶量即為1個單位(U)。

計算公式為U＝2400×5×D/(T×0.5)

式中：T為凝乳時間；D為稀釋倍數。