[發明專利]編碼β-半乳糖苷酶的基因及其表達和應用

無效

• 申請號: 200910001928.0
• 申請日: 2009-01-14
• 公開（公告）號: CN101597614A
• 公開（公告）日: 2009-12-09
• 發明（設計）人: 張偉;姚斌;伍寧豐;范云六;郭軍;張宇宏
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院生物技術研究所
• 主分類號: C12N15/56
• 分類號: C12N15/56;C12N9/38;C12N15/63;C12N1/21;C12N1/19
• 代理公司: 北京科龍寰宇知識產權代理有限責任公司
• 代理人: 孫皓晨;費碧華

技術領域

本發明涉及一種編碼β-半乳糖苷酶的基因，尤其涉及一種編碼β-半乳糖苷酶基因的克隆、表達及酶學性質研究，屬于酶的基因工程領域。

背景技術

牛乳與乳制品含有豐富的優質蛋白質、脂肪、碳水化合物以及幾乎全部已知的維生素和多種礦物質，尤其是其鈣含量高且鈣磷比例適當，易被人體消化吸收，還含有免疫球蛋白等抗病因子，是人類增強體質的理想食品。

乳糖是牛奶和乳清中的主要成分，乳糖約占牛奶干物質的30％，但溶解度低，在20℃水中溶解度僅為20％，而其甜度僅及蔗糖的16％，久貯的乳制品由于乳糖析出，呈砂樣感覺，影響風味。此外，許多成人，特別是嬰兒(因人種而異，西歐占2-8％，亞洲、非洲占60-90％)由于體內缺乏β-半乳糖苷酶，因此他們很難消化牛奶，飲用牛奶后，乳糖到了腸里，被腸道細菌分解發酵，產生大量二氧化碳氣體，使腸道膨脹，并興奮腸道蠕動，使收縮加強，造成腸鳴和腹瀉，這種疾病稱作乳糖不耐受癥(Berka?Randy?M.，Hucul，John?A.，Ward，Michael.Increased?production?of?beta-galactosidase?in?Aspergillus?oryzae.US?patent，5736374，1998，4～7)。利用外源性β-半乳糖苷酶將乳糖降解為易被人體吸收利用的單糖，水解條件溫和、產物簡單、口感好，且不會破壞牛乳中其他營養成分，是目前在低乳糖乳品加工中所采用的最好方法。

β-半乳糖苷酶(β-D半乳糖苷半乳糖水解酶，β-D-galactosidegalactohydrolase，EC?3.2.1.23)通常被稱為乳糖酶(Lactase)。β-半乳糖苷酶能將乳糖水解成為半乳糖和葡萄糖，同時具有半乳糖苷的轉移作用(張樹政主編.酶制劑工業下冊.北京：科學出版社，1984，818～819)，可用來生產低聚半乳糖。葡萄糖是人體各部分代謝的能量來源，半乳糖則是人大腦和粘膜組織代謝時所必需的結構糖，是嬰兒大腦發育的必要組織，與嬰兒大腦迅速生長有著密切的聯系。通過轉糖苷作用生成的低聚糖，是一種低分子量，不粘稠的水溶性膳食纖維，它在人體腸道內作為益菌增殖因子僅能被雙歧桿菌所利用，卻不被腐敗細菌所利用，如此可大大地減少腸道內有害毒素物質的產生，對預防便秘和腹瀉有很好的作用(秦立虎，韓啟文，張洪穎.β-半乳糖苷酶的作用及其在乳品工業中的應用.中國奶牛，2007，6：46～48)，可廣泛應用在食品、醫藥、飼料等領域，目前已成為β-半乳糖苷酶應用研究的另一熱點。

目前，商品化的β-半乳糖苷酶主要來源于微生物(相尺孝亮等著，酶應用手冊，上海科學技術出版社，1989，407～414)。例如來源于大腸桿菌(Escherichia?coli)、黑曲霉(Aspergillus?niger)、克魯維斯酵母(Kluyveromyces?lactis)及臭曲霉(Aspergillus?foetidus)等。在研究蛋白質合成及遺傳因子抑制的關系中，廣泛應用的大腸桿菌β-半乳糖苷酶是第一個被結晶的β-半乳糖苷酶，分子量為850,000Da。大腸桿菌的酶最適pH為7.0，但在Na+存在下最適pH變為6.6。

在乳品及其他食品工業中獲得有效應用的β-半乳糖苷酶主要是由克魯維斯氏酵母(Kluyveromyces?lactis)和曲霉中得到的。克魯維斯氏酵母是從牛乳中分離到的，其產生的β-半乳糖苷酶最適pH與新鮮牛乳的天然pH(6.6～6.8)相近，主要適用于分解牛乳及脫脂奶粉中的乳糖。該酶在pH6.2～7.0穩定，6.2～7.0以上或以下酶活迅速下降。最適溫度為35～40℃。分子量為135000Da。40℃處理1hr，pH在6.5～8.5之間穩定，即使處理3hr也同樣穩定，處理24hr?pH7～8穩定。40℃以上就急劇失活。Ca2+、Cu2+、Fe2+可以使酶失活，Mn2+、Mg2+可恢復Ca2+對酶的抑制，K+單獨存在就可以大大提高酶的熱穩定性(謝毅等，復旦學報(自然科學版)，1999，Vol.38，No.5：523-528)。以ONPG(鄰硝基苯酚-β-D半乳糖苷)為底物，40℃反應3min，Km為2.78mmol/L，最大反應速度為0.1umol/min，酶的水解產物半乳糖對酶的活性有強烈的抑制作用，值得注意的是，核糖的抑制作用也極為強烈，但其機理尚不清楚(沈為群等，生物工程學報，1993，9(4)：348～354；Dickson?R?C?et?al.，Journal?ofBacteriology，1980，142(3)：777～785)。