[發明專利]已溶血的全血樣品中待分析物的檢測

有效

• 申請號: 200880018981.5
• 申請日: 2008-06-04
• 公開（公告）號: CN101680885B
• 公開（公告）日: 2017-03-15
• 發明（設計）人: U·科博爾德;N·德爾莫特;C·休伯;H·馮德埃爾茨
• 申請（專利權）人: 霍夫曼-拉羅奇有限公司
• 主分類號: C07K14/00
• 分類號: C07K14/00;G01N33/50;G01N33/538;B01D15/34
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司72001
• 代理人: 劉鍇,黃可峻

本發明涉及在已溶血的全血樣品中待分析物的檢測方法，所述方法包括將已知或者疑似含有令人感興趣的待分析物的已溶血的全血樣品施加于到含有限進色譜材料(restricted access chromatography material(RAM))的柱子，從而結合所述待分析物，將所述待分析物從所述RAM上洗脫并檢測所述待分析物，其中，至少在第一步中使用pH高于8.0的緩沖液。所述新方法確保了血紅蛋白不干擾令人感興趣的待分析物的檢測。所述方法可容易地應用于例如來自已溶血的全血樣品的許多待分析物的在線檢測中，例如應用于抗生素、葉酸或諸如他克莫司(tacrolimus)或西羅莫司(sirolimus)等免疫抑制藥物的檢測。

背景技術

樣品中成份越多，其中所包含的目標待分析物的分析越困難。紅血細胞含有非常大量的蛋白質和小分子量成份，它們對諸如全血等生物流體中令人感興趣的待分析物的檢測可能具有潛在的干擾。這是為什么在臨床常規中分別使用血液血漿或簡稱為血漿(即抗凝全血樣品；除去細胞和紅細胞)或血液血清或簡稱為血清(即凝結全血；除去細胞、紅細胞凝結體系中的大部分蛋白尤其是纖維蛋白/纖維蛋白原)的主要原因之一。例如與血清或血漿相比，全血樣品液更難以處理。全血趨于更不穩定，并且紅細胞的緩慢破裂將破壞相當數量的令人感興趣的待分析物的可靠測量。

如上所述，可以由全血獲得血清或血漿并用于待分析物的檢測。理論上可以通過過濾或離心從全血中除去細胞和紅細胞。然而，這些方法要么不適用于常規診斷環境設置，要么它們不能進行至少部分存在于紅血細胞中的那些待分析物的正確測量。

在本領域中廣泛已知的用于全血樣品中待分析物的檢測的絕大多數方法都要求在待分析物能夠被量化之前對樣品進一步的處理。在許多方法中，首先通過選擇性沉淀或萃取方法從潛在干擾性物質中分離令人感興趣的待分析物。萃取可在液相中或固相上進行。通過分別描述在一些免疫抑制藥物或葉酸的檢測中使用的方法能對此進行舉例說明。

廣泛已知的免疫抑制藥物例如有霉酚酸酯(mycophenolate mofetil)(MMF)、納巴霉素(rapamycin)(RAPA，也稱為西羅莫司(sirolimus))和他克莫司(tacrolimus)(FK-506)。免疫抑制藥物的治療性藥物監測對于器官移植患者以及患有AIDS的患者尤其重要(參見，例如：Drug.Ther.Perspect.17(22)(2001)8-12)。大多數進行實體器官移植的患者需要終身免疫抑制治療以防止同種異體移植排斥。但是，因為許多免疫抑制劑具有很窄的治療范圍并且與各種毒性和潛在藥物相互作用相關，因此治療性藥物監測(TDM)和患者臨床評估的聯合使用將是尤其重要的。

他克莫司是首先于1994年獲得美國食品和藥物管理局(US Food andDrug Administration(FDA))批準的用于防止肝同種異體移植排斥的大環內酯類抗生素。于體外其效力比環孢霉素高多至100倍，并且臨床上，其與組織排斥發生率的更顯著降低有關。已證實他克莫司作為經受了各種移植過程的患者中的首要免疫抑制療法，以及作為在進行肝或腎移植后出現高排急性同種異體移植排斥(refractory acute allograftrejection)的患者中的搶救療法的療效。治療谷濃度(therapeutictrough concentration)為5-20μg/L。

由于存在于循環中的至少部分他克莫司被隔離在紅細胞中，因此在該藥物的臨床常規測量中使用全血樣品。例如可以通過高效液相色譜(HPLC)、與質譜(MS)聯用的HPLC、放射受體分析(RRA)或者通過免疫分析(IA)等檢測他克莫司。后兩種方法并不能利用相同的靈敏度檢測他克莫司及其某些代謝物。這將導致在所采用的方法中出現干擾(Murthy，J.N.等人，Clin.Biochem.31(1998)613-617)。至少在他克莫司的各種代謝物的檢測中，HPLC-MS-法可被作為黃金標準。然而，以上提到的所有方法均要求從全血中萃取他克莫司。通常，在臨床常規中使用乙腈從全血中萃取他克莫司，并且似乎不存在方法能夠進行全血樣品中他克莫司的在線測量。

與他克莫司相似，西羅莫司也是大環內酯抗生素。其首先于1999年獲得US FDA的批準用于防止腎移植后的同種異體移植排斥，并且實際上，在與環孢霉素和皮質類固醇聯合急性使用時也顯示出在該方面的令人鼓舞的結果。于體外，西羅莫司的功效比環孢霉素強多至100倍，并且臨床上，其表現出與環孢霉素的協同作用，也許能減少環孢霉素的劑量。治療谷濃度為5-15μg/L。