[發明專利]木聚糖酶活力的測定方法

有效

• 申請號: 200810249673.5
• 申請日: 2008-12-27
• 公開（公告）號: CN101477035A
• 公開（公告）日: 2009-07-08
• 發明（設計）人: 張永勤;王哲平
• 申請（專利權）人: 青島科技大學
• 主分類號: G01N21/27
• 分類號: G01N21/27
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及的是一種測定木聚糖酶活力的方法，具體涉及用MBTH法測定木聚糖 酶活力的方法尤其涉及測定過程中關鍵參數的選擇。

背景技術

木聚糖酶是可將木聚糖降解成低聚木糖和木糖的水解酶。近年來，因其在造紙工 業、食品工業、飼料工業、能源工業和環境科學等方面都具有較大的應用價值而引起 科研工作者的廣泛關注，并對其進行了相關研究。酶活力是衡量酶生物活力的重要指 標。木聚糖酶屬多糖水解酶，目前常用DNS法測定其酶活力，具體方法是分別取具有 一定濃度梯度的木糖溶液2mL于試管中，加入1.5-2.5mL?DNS試劑，混勻，在沸水浴 中加熱5-15分鐘，立即用冷水冷卻至室溫，加水定容至10-25ml，混勻，在540nm處 測吸光度A值。回收率測定：以木糖樣品采用標準品隨行對照法分別加入不同量的標 準木糖溶液，方法同上，測定木糖含量并計算回收率。雖然此法簡便、快捷，但靈敏 度相對較低，不利于某些科學研究和產品質量控制。

3-甲基-2-苯并噻唑酮腙(MBTH)可以與不同類型的有機化合物反應，例如含有 亞甲基的化合物，芳族胺類，羰基化合物，Schiff堿，糖類，苯酚類，甾類化合物等。 測定不受低濃度醋酸鹽和琥珀酸鹽緩沖液的干擾，對于不同聚合度的同類還原糖，其 還原端的顯色吸光系數基本相同。因此MBTH法的應用面不同，所采用的各項測定條 件也有所不同。3-甲基-2-苯并噻唑酮腙(MBTH)法常用于微量甲醛含量的測定，如 果將此法用于木聚糖酶活力測定需要選擇適宜的酶活力測定條件，提高測定結果的準 確性。

發明內容

針對已有技術的不足，本發明提供一種木聚糖酶活力的測定方法，該方法采用 3-甲基-2-苯并噻唑酮腙(MBTH)法來測定木聚糖酶活力。

以下詳細介紹本發明一種木聚糖酶活力的測定方法，A，制作用MBTH法測得的木 糖吸光度值與木糖濃度的標準對應關系曲線；B，用MBTH法檢測待測木聚糖酶水解木 聚糖后產生的相當于木糖的吸光度值；根據上一步驟制作的木糖濃度與測得的木糖吸 光度值之間的標準對應關系曲線確定待查木聚糖酶的酶解產物中在單位時間內所產 生的相當于木糖的還原糖的含量，以此來推算木聚糖酶的活力。

優化地；上述步驟A的具體步驟是；作用MBTH法測得的木糖吸光度值與木糖濃 度標準對應關系曲線；分別取6-15組不同濃度(0-0.032mg/mL)的木糖標準溶液2mL， 加入2mL?0.5當量的NaOH溶液，混勻，取1.2mL加入到試管中(做三個平行樣)，再 加入MBTH試劑0.6mL于75-85℃水浴加熱15-30min后趁熱加入硫酸鐵銨試劑1.2mL， 室溫冷卻后于波長620-680nm處測定木糖的吸光度值；根據每組木糖濃度與測得的木 糖吸光度值之間的關系繪制標準對應關系曲線；

優化地；上述步驟B的具體步驟是；用MBTH法檢測木聚糖酶的活力；將9.9mL 木聚糖溶液其濃度為2-4mg/mL，加入到錐形瓶中于25-40℃的水浴搖床中預熱 8-12min，加入預熱至相應溫度的木聚糖酶溶液0.1mL進行水解反應，水解時間為 30min，取水解液2mL，迅速加入到2mL?0.5當量的NaOH溶液中，混勻，取1.2mL加 入到試管中(做三個平行樣)，再加入MBTH試劑0.6mL于75-85℃水浴加熱15-30min 后趁熱加入硫酸鐵銨試劑1.2mL，室溫冷卻后于波長620-680nm處測定吸光度值，根 據上一步驟制作的木聚糖酶的活力與測得的木糖吸光度值之間的標準對應關系曲線 確定待查木聚糖酶的活力；木聚糖酶的活力單位可被定義為在上述條件下每分鐘產生 1nM相當于木糖的量為一個酶活力單位。其中MBTH試劑的制法是3mg/mL的3-甲基-2- 苯并噻唑酮腙溶液和1mg/mL的二硫蘇糖醇溶液等量混合即得，現用現配，一天內有 效。

優化地；上述硫酸鐵銨試劑的制法是0.5％(FeNH₄(SO₄)₂)·12H₂O，0.5％氨基磺酸， 0.5當量鹽酸。

優化地；上述木聚糖為樺木(birchwood)木聚糖或櫸木(beechwood)木聚糖。

優化地；上述木聚糖以50mM的丁二酸緩沖溶液或醋酸緩沖溶液為溶劑。

優化地；上述測定吸光度值的最佳波長為650nm。