[發明專利]ING4和IL-24雙基因共表達載體及其用途

有效

• 申請號: 200810244301.3
• 申請日: 2008-11-21
• 公開（公告）號: CN101591658A
• 公開（公告）日: 2009-12-02
• 發明（設計）人: 楊吉成;謝宇鋒
• 申請（專利權）人: 蘇州大學
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N15/24;C12N15/861;C12N7/01;A61K48/00;A61P35/00
• 代理公司: 蘇州創元專利商標事務所有限公司
• 代理人: 陶海鋒

技術領域

本發明屬于重組載體領域，具體涉及人ING4基因和人IL-24基因的共表達載體的制備及其用途。?

背景技術

腫瘤是當今社會影響人類健康的主要疾病之一，腫瘤的發生發展受體內多種基因的調控，腫瘤抑制基因正是參與這一調控的重要分子，很多腫瘤中都有某些腫瘤抑制基因失活，向缺失某種抑癌基因的細胞內導入正常的抑癌基因，則可逆轉腫瘤細胞的表型、抑制細胞增殖、誘導細胞凋亡，以達到治療目的，例如已經發現的人ING4基因(參見：公開號為CN101058809A的中國專利申請)和人IL-24基因。?

人ING4基因定位于12p13-31，基因跨距13kb，由8個外顯子和7個內含子組成，cDNA全長1380bp，編碼蛋白含249個氨基酸，是新近發現的一種細胞內腫瘤生長抑制因子，可與NF-κB蛋白的P65亞基結合抑制NF-κB蛋白的活性，引起對NF-κB敏感的IL-8等基因的表達量減少；可通過調節p53乙酰化狀態增強p53的轉錄活性；可抑制缺氧誘導因子HIF-1的活化等，從而抑制腫瘤血管生成和腫瘤細胞生長。?

白介素-24(interleukin-24，IL-24)基因原先被命名為黑色素瘤分化相關基因(melanomadifferentiation-associated?gene-7，mda-7)，由美國哥倫比亞大學的Jiang等人于1995年將增生活躍的人類黑色素瘤細胞HO-1產生的cDNA文庫與經人成纖維細胞β干擾素(IFN-β)和mezerein(MEZ)共同處理過的HO-1細胞的cDNA文庫進行減數雜交時首次發現(參見：JiangH，Lin?JJ，Su?ZZ等人，Oncogene，1995，11(12)：2477-2486.)。這一因子從其結構、染色體定位、堿基序列同源性及細胞因子特性等方面綜合考慮，被歸入IL-10家族，并命名為IL-24。IL-24為分泌型細胞因子，是一種膜受體介導的腫瘤生長抑制因子。目前的研究顯示，IL-24基因是第一個，很可能是唯一既抑制腫瘤細胞生長和血管形成并誘導凋亡，同時又能刺激免疫細胞表達細胞因子的新型抑癌基因，因而能通過抑制腫瘤血管生長，刺激免疫系統應答及誘導腫瘤細胞凋亡三者聯合的方式來發揮抗腫瘤效應。?

近年來腫瘤等疾病多基因治療倍受關注。于同一載體上同時表達多個外源基因在生物學領域中具有廣泛的應用價值，尤其在針對腫瘤等疾病發生發展的各個環節設計的聯合基因治療方案中。因而構建合適的載體獲得多個外源基因的高效轉移與表達具有重要意義。在細胞或整體水平轉移外源基因進行遺傳學改造、修飾是目前基因治療的重要方式。腫瘤等疾病的發生和發展是多基因變異的結果，同時轉移并表達多個外源基因在基因治療領域具有重要的應用價值。?

目前多基因治療主要采取兩種途徑：?

一是將多個攜帶不同基因的獨立載體同時轉染或感染靶細胞，其優點是可以自由調節各表達載體的比例和時間上協調組合，缺點是其實現多基因共表達的效率太低和工作量大；?

二是在同一載體上實現多基因共表達。低效的基因轉移過程是基因治療的瓶頸，與多個攜帶不同基因的獨立載體實現共表達相比，構建多基因共表達載體可提高轉移及表達效率。共表達主要應用于：(1)表達異源多聚體蛋白的亞單位，如免疫球蛋白、細胞受體、白細胞介素和轉錄因子等；(2)同時表達針對同一靶細胞的幾種異源蛋白以取得聯合或協同的作用，如原癌基因、抗血管生成基因、自殺基因等。尤其是自殺基因及其與免疫活性基因的聯合應用已在協同抗腫瘤的研究中取得了重要進展。大量的研究表明，聯合應用不同治療基因可以產生較單基因更有效的作用。現將多基因共表達載體構建策略概括如下：?

(1)基因之間以IRES(internal?ribosome?entry?site)(內部核糖體進入位點)序列連接；(2)雙啟動子表達載體；(3)剪切載體；(4)基因之間以Furin的切割靶點序列連接；(5)基因之間以2A序列連接；(6)表達融合基因。?

其中，IRES介導和雙啟動子介導的雙基因共表達模式是目前較常用的兩種構建方式，前者為在上游啟動子的控制下，該IRES序列及與之相連的基因可同時轉錄，并以不依賴帽的方式啟動遠端mRNA的翻譯，從而在同一個轉錄本上翻譯出不同的蛋白；后者為帶有polyA-promotor(CMV)各自獨立啟動子的兩個表達盒構建于一個載體上，轉錄出兩種不同的mRNA并翻譯出不同的蛋白。?