[發(fā)明專利]一種高通量檢測溶劑產(chǎn)生菌溶劑產(chǎn)量的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200810240859.4
• 申請日: 2008-12-26
• 公開（公告）號: CN101446579A
• 公開（公告）日: 2009-06-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張?zhí)烊?/a>;張延平;李寅
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院微生物研究所
• 主分類號: G01N33/00
• 分類號: G01N33/00;G01N21/17
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司
• 代理人: 關(guān) 暢;任鳳華

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種高通量檢測溶劑產(chǎn)生菌發(fā)酵液中溶劑產(chǎn)量的方法。

背景技術(shù)

目前，石油等化石燃料短缺、天然氣和其他原料價(jià)格上揚(yáng)、以及對溫室氣體減 排的要求，已迫使人們將注意力轉(zhuǎn)向可再生能源，關(guān)注生物燃料的發(fā)展前景。丁醇 就是受關(guān)注的生物燃料之一。丁醇是一種重要的化工原料，主要用于制造增塑劑、 溶劑、萃取劑等；丁醇又是一種極具潛力的新型生物燃料，其熱值、辛烷值與汽油 相當(dāng)，含氧量與汽油中常用的甲基叔丁基醚相近，不會腐蝕管道，便于管道輸送； 蒸汽壓低，安全性高，且能與汽油以任意比混合。因其有諸多優(yōu)點(diǎn)，因此被廣泛關(guān) 注及應(yīng)用，當(dāng)今市場上丁醇已經(jīng)供不應(yīng)求。

丁醇可由化學(xué)合成法和發(fā)酵法生產(chǎn)。化學(xué)合成法的主要路線包括兩條，一是以 丙烯為原料，經(jīng)羰基合成法生成正、異丁醛，加氫后分餾得到正丁醇；二是以乙醛 為原料，經(jīng)醇醛縮合成丁醇醛，脫水生成丁烯醛，再經(jīng)加氫后得到正丁醇。發(fā)酵法 則是以糧食為原料，經(jīng)發(fā)酵獲得溶劑(包括丙酮、丁醇、乙醇，質(zhì)量比約為3∶6∶ 1)，再經(jīng)精餾后分別制得丙酮、丁醇和乙醇。發(fā)酵法生產(chǎn)溶劑曾經(jīng)是僅次于乙醇發(fā) 酵的全球第二大發(fā)酵工業(yè)。

丁醇發(fā)酵中，溶劑毒性是影響溶劑產(chǎn)量的一個(gè)關(guān)鍵限制因素。在所產(chǎn)生的溶劑 中，丁醇是毒性最大的，當(dāng)其濃度達(dá)到13g/L，發(fā)酵就基本停止。研究發(fā)現(xiàn)，丁醇 毒性的機(jī)制與其疏水性有關(guān)，它會破壞細(xì)胞膜的磷脂成份，使膜的流動性提高，可 能會導(dǎo)致膜的不穩(wěn)定，破壞與膜相關(guān)的功能，如抑制與膜結(jié)合的ATP酶活性、降 低胞內(nèi)ATP水平、抑制細(xì)胞維持胞內(nèi)pH的能力、破壞細(xì)胞膜的pH梯度等。丁醇 毒性對細(xì)胞膜的進(jìn)一步影響是抑制糖和氨基酸的吸收，從而使代謝完全停滯。因此， 需要篩選出丁醇耐受能力高的菌株以用于生產(chǎn)，而篩選菌株的前提是建立一種高效 的檢測菌株發(fā)酵產(chǎn)物含量的方法。目前溶劑(包括丙酮、丁醇、乙醇)產(chǎn)量測定一 般用高效液相色譜或氣相色譜進(jìn)行，但此方法存在工作量很大、分析時(shí)間較長的缺 點(diǎn)，對于一次篩選出較多的菌株，產(chǎn)物分析需數(shù)天時(shí)間。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種檢測溶劑產(chǎn)生菌發(fā)酵液中溶劑產(chǎn)量的方法。

本發(fā)明的檢測溶劑產(chǎn)生菌發(fā)酵液中溶劑產(chǎn)量的方法，包括如下步驟：

1)使發(fā)酵液中的丙酮與可溶性次碘酸鹽反應(yīng)，得到碘仿；

2)檢測所述碘仿的量，根據(jù)所述碘仿的量得到所述丙酮的量；

3)根據(jù)所述丙酮的量，得到所述溶劑的量；

所述溶劑為丙酮和如下有機(jī)溶劑中的至少一種：乙醇和丁醇。

其中，所述使丙酮與可溶性次碘酸鹽反應(yīng)的方法為向所述發(fā)酵液中加入可溶性 堿、可溶性碘鹽和碘。其中的丙酮可與次碘酸鈉反應(yīng)生成碘仿，碘仿不溶于水，可 通過酶標(biāo)儀檢測得到碘仿的OD值，然后根據(jù)OD值與丙酮濃度間的換算關(guān)系式得到 丙酮產(chǎn)量。

本發(fā)明所述的溶劑產(chǎn)生菌產(chǎn)生的溶劑種類是已知的，且各產(chǎn)物與丙酮的質(zhì)量存 在一定比例關(guān)系，且比例值是已知的，如Clostridium?acetobutylicum?DSM1731的發(fā) 酵液中，丙酮、乙醇和丁醇的質(zhì)量比為3∶1∶6(Nutritional?factors?affecting?the?ratio of?solvents?producted?by?Clostridium?acetobutylicum，Applied?and?Environmental microbiology，1986，169-172)，因此，可以根據(jù)丙酮的量計(jì)算出其它溶劑的量，進(jìn) 而得到總?cè)軇┑漠a(chǎn)量。

所述溶劑產(chǎn)生菌可以為丙酮丁醇梭菌和/或拜氏梭菌和/或糖丁酸梭菌，具體可 如Clostridium?acetobutylicum?DSM1731、Clostridium?acetobutylicum?ATCC824。

實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的檢測溶劑產(chǎn)生菌發(fā)酵液中溶劑產(chǎn)量的方法，檢測結(jié)果可靠 準(zhǔn)確，與高效液相色譜法檢測結(jié)果相當(dāng)，但操作上比其簡單、檢測速度快，而且成 本低廉，因此，本發(fā)明方法可以實(shí)現(xiàn)高通量快速檢測，在菌的溶劑產(chǎn)量檢測中將會 有廣闊的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1為丁醇標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相色譜圖。

圖2為乙醇標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相色譜圖。

圖3為丙酮標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相色譜圖。

圖4為Clostridium?acetobutylicum?DSM1731發(fā)酵液的高效液相色譜圖。