[發明專利]豬源大腸桿菌中抗銅基因pcoA的PCR檢測方法

無效

• 申請號: 200810233785.1
• 申請日: 2008-12-31
• 公開（公告）號: CN101445833A
• 公開（公告）日: 2009-06-03
• 發明（設計）人: 侯春;貢嬌娜;竇秋燕;張智輝;孫放
• 申請（專利權）人: 云南大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/02
• 代理公司: 昆明今威專利代理有限公司
• 代理人: 楊宏珍

技術領域：

本發明涉及一種豬源大腸桿菌中抗銅基因pcoA的PCR檢測方法，屬檢測技術領域。

背景技術：

長期以來抗菌劑(包括抗生素，硫酸銅)被作為生長促進劑添加到飼料中，在增加動物養殖效益的同時導致高頻率的抗生素抗性細菌的出現，這些抗性細菌攜帶的抗性基因可以被轉移到在人類致病菌，這是對人類健康的潛在威脅。Aarestrup等推測禁止使用抗生素作為生長促進劑添加到豬飼料中后，在養豬場抗生素抗性細菌仍然保持高發生率的原因可能是由于銅仍然被添加到豬飼料中作為生長促進劑，它們選擇抗生素抗性細菌并維持了它們的發生率(Aarestrup，F.M.，H.Hasman，L.B.Jensen，et?al.2002.Antimicrobial?resistance?amongenterococci?from?pigs?in?three?European?countries.Appl.Environ.Microbiol.68：4127-4129.)。國外已經報道從養豬場分離到抗銅的腸球菌(Enterococcus?faecium)帶有抗銅基因tcrB(Aarestrup，F.M.，H.Hasman，L.B.Jensen，et?al.2002.Antimicrobial?resistance?among?enterococci?frompigs?in?three?European?countries.Appl.Environ.Microbiol.68：4127-4129.)，和抗銅的大腸桿菌(E.coli)帶有抗銅基因pcoABCDRSE(Silver，S.，Lee，B.T.O.，Brown，N.L.et?al(1993).Bacterial?plasmid?resistanceto?copper，cadmium?and?zinc.In?Chemistry?of?Copper?and?Zinc?Triads，pp.38-53.Edited?by?A.J.Welch.London：The?Royal?Socirty?of?Chemistry.)，這些抗銅基因都位于接合質粒上。Hasman?&?Aarestrup進一步對分離到的抗銅腸球菌(E.faecium)進行研究發現：抗銅基因tcrB、抗糖肽類抗生素的基因簇vanA和抗大環內酯類抗生素的基因ermB位于同一個接合質粒上(Hasman，H.，andF.M.Aarestrup.2002.tcrB，a?gene?conferring?transferable?copperresistance?in?Enterococcus?faecium：occurrence，transferability，andlinkage?to?macrolide?and?glycopeptide?resistance.Antimicrobial?Agentsand?Chemotherapy?46：1410-1416.)。

目前我國的豬飼養業仍然在飼料中添加抗生素和銅鹽、鋅鹽作為生長促進劑，這必然對豬肉產品安全造成威脅。快速檢測豬源大腸桿菌中是否存在抗性基因對評價豬肉產品安全具有重要意義。而常規PCR檢測程序需要從細胞中提取DNA樣品，耗時長，試劑消耗多，造成檢測樣品周期長成本高。本發明采用豬源大腸桿菌單菌落直接做DNA模板，實現了用PCR方法快速、經濟地檢測大腸桿菌中的抗銅基因pcoC。

經文獻檢索，未見與本發明相同的公開報道。

發明內容：

本發明的目的在于克服現有檢測方法之不足，而提供一種能快速檢測豬源大腸桿菌中抗銅基因pcoA的方法。

本發明的檢測方法包括：用于PCR檢測的豬源大腸桿菌單菌落培養物的制備；抗銅基因pcoA的引物序列；PCR反應液組成；PCR擴增反應條件；PCR擴增產物的檢測方法。其中：

用于PCR檢測的豬源大腸桿菌單菌落培養物的制備方法：將分離到的待檢測的豬源大腸桿菌菌株劃線接種在牛肉膏蛋白胨培養基平板上，在37℃溫度下培養18-36h后得到單菌落。

抗銅基因pcoA的引物序列為：上游：5’CGTCTCGACGAACTTTCCTG3’；下游：5’GGACTTCACGAAACATTCCC3’；PCR擴增產物大小為：1750bp。