[發明專利]自動物樣品中提取鹽霉素類化合物的方法及其專用免疫親和吸附劑

有效

• 申請號: 200810227785.0
• 申請日: 2008-12-03
• 公開（公告）號: CN101433825A
• 公開（公告）日: 2009-05-20
• 發明（設計）人: 沈建忠;張素霞;史為民;萬宇平;曹興元;江海洋;馮才偉;李建成;王戰輝
• 申請（專利權）人: 中國農業大學
• 主分類號: B01J20/286
• 分類號: B01J20/286;C07D493/20
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司
• 代理人: 關 暢;任鳳華

技術領域

本發明涉及一種自動物樣品中提取鹽霉素類化合物的方法及其專用免疫親和 吸附劑。

背景技術

隨著生命科學的發展，人們對生物體內的物質及其變化產生了越來越濃厚的興 趣，而生物樣本的分析就成為探索和發現生命奧秘的必要手段。由于生物樣本成分 復雜，待測物濃度較低，而且大多數取樣量很少，這就對分析方法的選擇性和靈敏 度提出了更高的要求。免疫親和色譜(IAC，immunoaffinity?chromatography)是 一種將免疫反應與色譜分析方法相結合的分析方法。它的高度選擇性和高親和性無 疑使分析過程簡化。在獸藥殘留分析中，IAC最簡單而且最有效的應用方式是作為 理化測定技術(如HPLC，GC)的樣品凈化手段，這種聯用方法可使免疫學技術和理 化技術在選擇性、分離能力、速度和靈敏度方面得到互補，并避免了免疫分析法(如 ELISA，RIA)直接測定樣品的諸多不足。

鹽霉素(Salinomycin)和甲基鹽霉素(Narasin)屬于聚醚類獸用抗生素， 對大多數革蘭氏陽性菌和部分霉菌起抗菌作用，單獨使用對雞球蟲病有良好的預防 作用。鹽霉素和甲基鹽霉素的使用不可過量，否則其將會在動物體內大量蓄積，通 過食物鏈而危及人類健康，重者會使所食用動物中毒死亡。2002年12月我國農業 部公告第235號文規定鹽霉素和甲基鹽霉素在雞肌肉中最高殘留量為600μg/kg， 在皮膚、脂肪中的最高殘留量為1200μg/kg，在肝中的最高殘留量為1800μg/kg。 歐盟自2006年，不再允許鹽霉素-鈉在飼料中添加。因此，檢測鹽霉素和甲基鹽霉 素在動物性食品中的殘留量非常重要。

檢測鹽霉素和甲基鹽霉素殘留量的方法主要有高效液相色譜分析法(HPLC)、 液-質聯機(LC-MS)、液質串聯質譜法(LC-MS/MS)等；這些方法的前處理利用液—液 分配，常規的SPE柱凈化和分離，都在不同程度地存在著處理過程繁瑣、凈化效果 差、有機溶劑浪費多、所需時間長等缺點。

發明內容

本發明的一個目的是提供一種用于自動物樣品中提取鹽霉素類化合物的免疫 親和吸附劑。

本發明所提供的用于自動物樣品中提取鹽霉素類化合物的免疫親和吸附劑，是 由固相載體和與其偶聯的鹽霉素單克隆抗體組成；所述鹽霉素單克隆抗體是以鹽霉 素半抗原與載體蛋白的偶聯物為免疫原得到的抗體；所述鹽霉素類化合物為鹽霉素 或甲基鹽霉素。

其中，所述鹽霉素半抗原是通過將鹽霉素和氯化亞砜縮合反應得到鹽霉素酰 氯，再將所述鹽霉素酰氯與氨基乙酸反應得到的；所述鹽霉素單克隆抗體為鹽霉素 鼠單克隆抗體。所述鹽霉素單克隆抗體可以為鹽霉素鼠單克隆抗體。

所述鹽霉素單克隆抗體具體是由鹽霉素單克隆抗體雜交瘤細胞株C-3-3CGMCC No.2587分泌產生。

所述鹽霉素單克隆抗體是用鹽霉素半抗原與載體蛋白的偶聯物作為免疫原得 到的；所述鹽霉素半抗原將鹽霉素和氯化亞砜通過縮合反應得到鹽霉素酰氯，再將 鹽霉素酰氯與氨基乙酸反應得到鹽霉素半抗原。

鹽霉素是小分子物質，只有免疫反應性，沒有免疫原性，不能誘發機體產生免 疫應答，必須與大分子載體蛋白偶聯后才具有免疫原性。本發明將鹽霉素反應合成 鹽霉素半抗原，有助于制出針對鹽霉素抗原特異性較強的多克隆抗體。再將鹽霉素 半抗原采用碳化二亞胺法與載體蛋白偶聯得到免疫原。半抗原與載體蛋白的結合比 例過低或過高都對免疫不利，半抗原與OVA、RSA和KLH的結合摩爾比分別為11：1、 17：1、17：1。

所述載體蛋白可為鼠血清蛋白、牛血清白蛋白、兔血清蛋白、人血清白蛋白、 卵清蛋白或血藍蛋白等常用載體蛋白；

所述固相載體可為纖維素、葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠、多孔玻璃、瓊脂糖 凝膠、聚丙烯酰胺-瓊脂糖凝膠等，優選為Sepharose?4B。

所述免疫親和吸附劑可裝載入柱中制成免疫親和色譜柱，該免疫親和色譜柱也 屬于本發明的保護范圍。

含有上述免疫親和吸附劑或免疫親和色譜柱的試劑盒也屬于本發明的保護范 圍。

所述試劑盒中還可包括洗脫液、洗滌液和保存液；