[發明專利]一種高效的ELP融合蛋白酶及其制備和應用

無效

• 申請號: 200810219603.5
• 申請日: 2008-12-02
• 公開（公告）號: CN101418290A
• 公開（公告）日: 2009-04-29
• 發明（設計）人: 徐安龍;藍東明;黃光瑞;王磊;陳尚武
• 申請（專利權）人: 中山大學
• 主分類號: C12N9/50
• 分類號: C12N9/50;C12N15/62;C12N15/70;C12P21/06
• 代理公司: 廣州新諾專利商標事務所有限公司
• 代理人: 華 輝

技術領域

本發明涉及一種重組的融合蛋白酶，以及該蛋白酶在切割融合蛋白中的應用。

背景技術

隨著大規模測序技術發展和廣泛應用，人類基因組計劃及其他物種包括海膽、斑馬魚、文昌魚等基因組計劃也相繼完成。對這些物種的基因組測序的直接結果是產生成千上萬個基因，對這些基因功能的闡明，有助于我們了解物種在進化過程的位置；對導致疾病的基因的研究有助于了解發病機理，尋找治療的靶點，開發治療相應治療藥物；同時，大量的藥物蛋白基因也有待我們去研究其生理活性，及作用靶點，為開發新型的治療藥物提供基礎。基因功能研究的方法很多，包括基因敲除技術，蛋白組學的研究，RNA干擾等。其中一個最直接的研究方法是把所研究的基因進行重組表達，獲得相應的蛋白后進行生理和生化活性的研究和對其進行結構生物學的分析從而闡明其功能。由于物種基因的差異性，并不是所有的基因都能成功地表達。基因不表達，蛋白表達量低或表達的蛋白不穩定形成不可溶的包涵體，這些現象在異源表達系統中經常出現，特別在原核表達系統中表達真核生物基因。隨著DNA重組技術的發展，可以將目的基因與表達親和標簽的基因進行融合，然后克隆在表達載體中進行融合表達，這些親和標簽不但可以幫助所融合的目的蛋白折疊，提高目的蛋白的可溶性和表達量，同時親和標簽能與相應的親和層析的樹脂結合，起到一步純化融合蛋白的作用。常用的親和純化標簽包括谷胱甘肽-S-轉移酶(Glutathione-S-Transferase，GST)，麥芽糖結合蛋白(Maltose-binding?Protein，MBP)，His標簽等。最后利用蛋白酶對含有相應蛋白酶酶切位點的融合蛋白進行切割，使目的蛋白與親和標簽蛋白分離開，通過進一步的層析分離除去親和標簽和蛋白酶而獲得目的蛋白。

親和層析是一種非常有效的分離方法，在不需要了解所融合蛋白的物化性質的情況，就可以實現一步純化融合蛋白，這種純化技術被廣泛應用。但是，應用親和層析分離技術需要昂貴的親和樹脂，和相應的純化設備，這樣限制了同時表達多種蛋白用于高通量的結構生物學研究和高通量的藥物蛋白篩選。1999年，報道了一個熱敏感的純化標簽彈性蛋白樣多肽(Elastin?Like?Polypeptides，ELP)，這個標簽起源于彈性蛋白的重復的五肽“Val-Pro-Gly-Val-Gly”。ELP可以經歷一個可逆相變過程，稱為反溫度相變(Inverse?TemperatureTransition)。當溫度低于相變溫度(Transition?temperature，Tt)時，ELP在液相表現出高度可溶，然而當溫度高于Tt時，親水的ELP則會脫水而發生凝集，而且ELP融合蛋白也具有這種特性，但是需要指出的是發生相變的時候只是ELP發生凝結而所融合的外源蛋白并沒有發生變性或沉淀。利用ELP的這種特性，可以方便和快速地利用ELP標簽來純化ELP融合蛋白，而且純化過程中不需要層析分離而避免了昂貴的親和樹脂和純化設備，同時ELP融合蛋白的濃縮和更換緩沖液也變得非常簡單。通過加熱或提高鹽離子濃度觸發ELP融合蛋白的凝集，通過離心使ELP融合蛋白于表達宿主蛋白中分離出來，用低鹽低溫的溶液使沉淀的ELP融合蛋白重新溶解，再進行離心除去不可溶的蛋白而獲得ELP融合蛋白，通過重復觸發沉淀、離心和重溶步驟可以獲得更純的ELP融合蛋白，這種純化過程稱之為逆相循環(Inverse?TransitionCycling，ITC)。