[發(fā)明專利]活細(xì)胞核質(zhì)成像的方法及其在活細(xì)胞核質(zhì)信號傳導(dǎo)通路監(jiān)測的應(yīng)用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200810219085.7
• 申請日: 2008-11-14
• 公開（公告）號: CN101738462A
• 公開（公告）日: 2010-06-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鄧小元;金鷹
• 申請（專利權(quán)）人: 華南師范大學(xué)
• 主分類號: G01N33/48
• 分類號: G01N33/48;G01N21/64
• 代理公司: 廣州粵高專利商標(biāo)代理有限公司 44102
• 代理人: 禹小明

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及細(xì)胞分子生物學(xué)和非線性光學(xué)顯微成像領(lǐng)域，具體來說是一種活細(xì)胞核質(zhì)成像的方法及其在活細(xì)胞核質(zhì)信號傳導(dǎo)通路監(jiān)測的應(yīng)用。

背景技術(shù)

多細(xì)胞生物是一個繁忙而有序的細(xì)胞社會，這種社會性的維持不僅依賴于細(xì)胞的物質(zhì)代謝與能量代謝，還有賴于細(xì)胞通訊與信號傳遞，從而以不同的方式協(xié)調(diào)它們的行為，諸如細(xì)胞生長、分裂、死亡、分化及其各種生理功能。

生物體細(xì)胞之間的信息轉(zhuǎn)導(dǎo)可通過相鄰細(xì)胞的直接接觸來實(shí)現(xiàn)，但更重要的也是更為普遍則是通過細(xì)胞分泌各種化學(xué)物質(zhì)來調(diào)節(jié)自身和其它細(xì)胞的代謝和功能。細(xì)胞接受外界信號，通過一整套特定的機(jī)制，將胞外信號轉(zhuǎn)導(dǎo)為胞內(nèi)信號，最終調(diào)節(jié)特定基因的表達(dá)(細(xì)胞核內(nèi))，引起細(xì)胞的應(yīng)答反應(yīng)，這是細(xì)胞信號系統(tǒng)的主線，這種反應(yīng)系列稱之為細(xì)胞信號通路(Signaling?Pathway)。因此，在人體中，信號傳導(dǎo)通路通常是由分泌釋放信號物質(zhì)的特定細(xì)胞、信息物質(zhì)(包含細(xì)胞間與細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、分子、離子等)以及靶細(xì)胞(包含特異受體等)等構(gòu)成。

信號傳導(dǎo)通常包括以下步驟：特定的細(xì)胞釋放信息物質(zhì)→信息物質(zhì)經(jīng)擴(kuò)散或血循環(huán)到達(dá)靶細(xì)胞→與靶細(xì)胞的受體特異性結(jié)合→受體對信號進(jìn)行轉(zhuǎn)換并啟動細(xì)胞內(nèi)信使系統(tǒng)→靶細(xì)胞產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)。

其中，轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞內(nèi)信息傳遞中起著非常重要的作用，基因轉(zhuǎn)錄過程由這些調(diào)節(jié)蛋白所控制，它們的結(jié)構(gòu)中含有特異性區(qū)域，即DNA結(jié)合區(qū)域，能與靶基因調(diào)節(jié)區(qū)域(即啟動子和增強(qiáng)子)上的特定DNA序列結(jié)合。根據(jù)其DNA結(jié)合區(qū)域的不同，轉(zhuǎn)錄因子被分為不同家族，如核因子NF-κB(Nuclear?factor?kappa?B)(張寧譯徐永健校核因子KB：一種新的治療途徑？德國醫(yī)學(xué)1999，5：261)、JAK/STAT、DREB等。因此有效監(jiān)控這些轉(zhuǎn)錄因子在核質(zhì)間(細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核之間)的轉(zhuǎn)運(yùn)過程有助于增進(jìn)了解細(xì)胞內(nèi)信號通路，從而對我們進(jìn)一步理解腫瘤的產(chǎn)生機(jī)制以及藥物的作用機(jī)制具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

熒光標(biāo)定技術(shù)是將熒光標(biāo)記物與特異性目標(biāo)分子相結(jié)合，通過研究熒光標(biāo)記物的行為來示蹤目標(biāo)分子的行為。熒光標(biāo)記物包括所有具備熒光發(fā)射基團(tuán)的物質(zhì)，如小分子的熒光染料(Fluorescein，Rhodamine，Texas?Red等)、生物熒光大分子(GFP及其衍生物等)、量子點(diǎn)(Quantum?Dots)熒光探針等。熒光標(biāo)記物與目標(biāo)分子的結(jié)合方式包括：直接的特異性結(jié)合(DNA與溴化乙啶EB)、通過抗原抗體介導(dǎo)的間接結(jié)合(免疫熒光標(biāo)定技術(shù))、通過基因重組將生物熒光分子與特定的目標(biāo)分子相結(jié)合的標(biāo)定技術(shù)(如本發(fā)明所使用的GFP標(biāo)定NF-κB的方法)等。

目前研究轉(zhuǎn)錄因子(如核因子NF-κB)活細(xì)胞內(nèi)調(diào)控通路的單光子共焦顯微成像的研究中，要獲得熒光標(biāo)記的NF-κB激活前后在核質(zhì)間的動態(tài)分布的信息，首先需要明確細(xì)胞核的位置，這通常由下面的方法來實(shí)現(xiàn)：(1)熒光標(biāo)記蛋白在細(xì)胞質(zhì)中大量聚集，而細(xì)胞核中濃度極低，以熒光分布的強(qiáng)弱大致判斷細(xì)胞核的位置；(2)利用其它熒光染料對細(xì)胞核進(jìn)行標(biāo)定，通過圖像疊加確定目標(biāo)蛋白在細(xì)胞核位置的濃度變化；(3)轉(zhuǎn)換到明視場對細(xì)胞核成像等。但它們帶來相應(yīng)方法上的不足：其中方法(1)實(shí)施的前提是篩選到熒光蛋白高表達(dá)的細(xì)胞株，而這種異常高表達(dá)一方面對細(xì)胞的正常生理活動會有潛在的影響，另一方面也給細(xì)胞株的篩選和維持帶來困難。方法(2)在樣品的準(zhǔn)備過程中增加了一道細(xì)胞核熒光染色的程序，外源性的熒光染料進(jìn)入可能會對細(xì)胞的生理狀態(tài)造成一定的影響，并且如果使用在低表達(dá)細(xì)胞株的情況下(對細(xì)胞盡可能微小的外部干擾下)，對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的采集造成困難，從而無法實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞盡可能造成微小外部干擾狀態(tài)下的動態(tài)研究；方法(3)頻繁的進(jìn)行光路變化帶來繁瑣的操作。

隨著二十世紀(jì)九十年代飛秒激光技術(shù)的出現(xiàn)，近年來快速發(fā)展的非線性雙光子顯微成像技術(shù)為活體細(xì)胞下分子水平的生物醫(yī)學(xué)研究提供了更加有力的工具。

與單光子共焦顯微成像相比，雙光子顯微成像具有以下優(yōu)勢：

(1)由于依賴于兩個光子在焦平面的同時(shí)作用，非聚焦平面可能發(fā)生的概率極小，具有清晰的自動三維(3D)斷層能力，同時(shí)極大程度地降低了焦平面外的光漂白作用和光毒性，可實(shí)現(xiàn)樣品長時(shí)間的活體成像。

(2)同時(shí)由于較長近紅外波長的采用，降低了生物組織對光的吸收和散射效應(yīng)，成像深度大大增加。