[發(fā)明專利]基于DNA信號轉(zhuǎn)換的磁顆粒/微電極檢測方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200810211353.0
• 申請日: 2008-09-23
• 公開（公告）號: CN101684503A
• 公開（公告）日: 2010-03-31
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 高利增;張芳
• 申請（專利權(quán)）人: 武漢哇哇噻納技術(shù)開發(fā)有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;G01N33/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

[技術(shù)領(lǐng)域]

本發(fā)明涉及生物醫(yī)學領(lǐng)域的一種體外檢測方法，將檢測DNA、蛋白質(zhì)、化學分子等信號均可轉(zhuǎn)換為檢測DNA的信號，通過DNA信號轉(zhuǎn)換實現(xiàn)對多種樣品的檢測。

[背景技術(shù)]

目前生物檢測通常采用是借助抗體、特異性配體進行檢測，但抗體或配體蛋白活性不穩(wěn)定，容易失活，而且所需條件嚴格，制備昂貴，不利于生物樣品的檢測。

而DNA則具有很好的穩(wěn)定性，合成制備方便廉價，在生物檢測中具有明顯的優(yōu)勢，常能獲得極高的信噪比和靈敏度。因此在生物樣品檢測中通過DNA信號轉(zhuǎn)換，將檢測抗體或配體蛋白的信號轉(zhuǎn)換為檢測DNA的信號，從而確定待測生物樣品，成為生物樣品檢測的已大趨勢。美國Northwest?University的Mirkin教授實現(xiàn)了無需PCR擴增的炭疽DNA電學檢測(Science?301，1884-1886，2003)，在檢測前列腺腫瘤標志物PSA時，引入DNA作為信號放大分子，通過PCR或生物芯片技術(shù)檢測DNA，從而實現(xiàn)了對PSA的高靈敏檢測。

但是，使用PCR或生物芯片具有一定的局限性。PCR需要設(shè)備昂貴，耗時長，而且其靈敏度有限；生物芯片容易產(chǎn)生高背景，不易重復，生物芯片采用的是固液雜交，效率低。

[發(fā)明內(nèi)容]

針對現(xiàn)有技術(shù)的上述缺點，本發(fā)明所要達到的技術(shù)目的是提供一種高靈敏、特異性好、穩(wěn)定的檢測方法，將檢測信號轉(zhuǎn)換為檢測DNA的信號，所有的實驗過程均是液相雜交。

技術(shù)方案，本發(fā)明提出DNA信號轉(zhuǎn)換與磁顆粒分離-微電極檢測相結(jié)合的路線，包括兩種方案，第一種方案步驟如下(圖1)：1)富集，利用特異性標記物1(L1)修飾的磁納米顆粒在液相中富集待檢測物質(zhì)，待測物質(zhì)可以為核酸、蛋白，包括DNA、RNA、抗原、抗體等；2)可加入親和素標記的特異性標記物2(L2)；3)得到磁顆粒L1-待測物質(zhì)-L2親和素復合物后，加入生物素化的雙鏈DNA(雙鏈DNA只有其中一條的5’端被生物素化)；4)得到磁顆粒L1-待測物質(zhì)-L2親和素-生物素雙鏈DNA復合物后，經(jīng)94℃處理去雜交，得到游離的單鏈DNA；5)游離的單鏈DNA利用我們已經(jīng)建立的磁顆粒分離-微電極檢測方法(參見專利。。。。)進行檢測，DNA的信號強度代表了待檢測物質(zhì)的信號強度，從而實現(xiàn)了待檢測物質(zhì)的檢測。

第二種方案步驟如下(圖2)：1)富集，利用特異性標記物1(L1)修飾的磁納米顆粒在液相中富集待檢測物質(zhì)，待測物質(zhì)可以為核酸、蛋白，包括DNA、RNA、抗原、抗體等；2)可加入納米微球(如硅納米顆粒，聚苯乙烯微球等)標記的特異性標記物2(L2)，同時在納米微球表面還標有大量的雙鏈DNA；3)得到磁顆粒L1-待測物質(zhì)-L2納米微球/DNA復合物后，經(jīng)94℃處理去雜交，得到游離的單鏈DNA；5)游離的單鏈DNA利用我們已經(jīng)建立的磁顆粒分離-微電極檢測方法(參見專利200610086617.5)進行檢測，DNA的信號強度代表了待檢測物質(zhì)的信號強度，從而實現(xiàn)了待檢測物質(zhì)的檢測。

DNA信號轉(zhuǎn)換，有以下優(yōu)點：1)DNA性質(zhì)穩(wěn)定，不易失活，其雜交規(guī)律了解比較清楚，特異性高；2)DNA制備廉價快速，滿足多種需要；3)DNA設(shè)計與改造方便，可以根據(jù)不同實驗設(shè)計不同的DNA序列，便于多樣化檢測。

液相雜交，有以下優(yōu)點：1)采用葡聚糖或瓊脂糖或殼聚糖修飾的磁顆粒，能夠減少雜交、銀染過程中的非特異性吸附；2)磁顆粒直徑小于1μm，特異性標記物L1可以較均勻、有序地修飾到磁納米顆粒表面；3)磁納米顆粒大大增加了特異性標記物分子與待測樣品的反應界面，能夠有效地富集待測物質(zhì)(見圖3)；4)磁納米顆粒均一分散在反應液中，反應更加接近生理環(huán)境。均勻有序的修飾，高反應界面，液相中均一分散使得反應時間更快、靈敏度更高、特異性更好。

磁顆粒-微電極檢測系統(tǒng)，參見專利檢測系統(tǒng)靈敏、快速、穩(wěn)定，特異性地檢測生物大分子。可以結(jié)合自動化裝置，構(gòu)建一種生物大分子的雜交、銀染、均借助一集成的自動化檢測裝置完成的自動化檢測儀，無需手工逐步操作。

[附圖說明]

圖1為本發(fā)明所創(chuàng)新DNA信號轉(zhuǎn)換與磁顆粒-微電極檢測相結(jié)合的檢測系統(tǒng)(方案一)。

1為磁顆粒，2為能夠結(jié)合磁顆粒的特異性標記物L1，3為待測物質(zhì)，4為特異性標記物L2，5為標記L2的親和素，6為生物素，7為雙鏈DNA，8為磁顆粒-微電極檢測系統(tǒng)中與信號轉(zhuǎn)換DNA特異識別的DNA探針1，9為雙鏈DNA中去雜交獲得的單鏈DNA，用于信號轉(zhuǎn)換放大，10為特異識別信號轉(zhuǎn)換DNA的探針2標記的金顆粒。