[發(fā)明專利]一種快速酶解混合蛋白質(zhì)的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200810207956.3
• 申請日: 2008-12-26
• 公開（公告）號: CN101457247B
• 公開（公告）日: 2011-11-09
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李友元;李雅萍;王永紅;陳長華;儲炬;莊英萍;張嗣良
• 申請（專利權(quán)）人: 華東理工大學(xué)
• 主分類號: C12P21/06
• 分類號: C12P21/06;G01N27/64
• 代理公司: 上海專利商標事務(wù)所有限公司 31100
• 代理人: 徐迅;陳靜

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及一種快速酶解混合蛋白 質(zhì)的方法。

背景技術(shù)

目前用于蛋白質(zhì)鑒定主要有二維電泳-質(zhì)譜和多維色譜-質(zhì)譜兩大技術(shù)。前 者，復(fù)雜的混合蛋白質(zhì)用雙向電泳分離，經(jīng)膠內(nèi)酶解，肽段主要用 MALDI-TOF-MS檢測，通過肽質(zhì)量指紋法(PMF)進行鑒定，亦可進行串聯(lián)質(zhì)譜 分析，通過肽段的序列信息來進行鑒定。后者是混合蛋白質(zhì)經(jīng)消化后，混合多 肽用二維液相色譜在線分離，再進行MS/MS分析實現(xiàn)蛋白質(zhì)鑒定。盡管二維 凝膠電泳技術(shù)有所改進，其分離蛋白質(zhì)的能力已經(jīng)使膠內(nèi)酶解適合分析非常復(fù) 雜的蛋白質(zhì)復(fù)合物，但是一些低豐度蛋白、極大極小分子量蛋白、極酸或極堿 蛋白和疏水性蛋白質(zhì)用這種凝膠的方法仍不易鑒定。另一方面，膠內(nèi)消化操作 需要花費更多的時間，消化后需要一系列化學(xué)處理和提取/純化步驟以回收消化 碎片，冗長的樣品制備程序增加了污染蛋白質(zhì)的可能性。而2D-LC的方法中， 蛋白質(zhì)消化是直接在溶液中完成的，溶液中消化只需相當少的時間和樣品準備 程序。但由于一些蛋白質(zhì)不易被酶解，因而加入如化學(xué)變性劑、表面活性劑等 促進蛋白質(zhì)溶解和消化，這些對MALDI分析有影響的試劑必須在質(zhì)譜分析前 從消化碎片中去除，使純化步驟變得比膠內(nèi)消化方法更加麻煩。因此，樣品的 預(yù)處理和胰蛋白酶消化過程不僅慢而且已經(jīng)成為用質(zhì)譜進行高通量鑒定蛋白 質(zhì)的限制性步驟。到目前為止，已報道不同的方法能夠減少蛋白質(zhì)鑒定前樣品 預(yù)備的時間，這些方法主要專注于提高樣品處理的通量，都基于在消化過程中 提高溫度，使用含有流動胰蛋白酶的柱，或加入有機溶劑，或用超聲波和微波 增強胰蛋白酶消化力等等。

Zee-Yong?Park等人提出了在蛋白質(zhì)溶液中消化和質(zhì)譜分析肽質(zhì)量譜圖之 前進行蛋白質(zhì)的熱變性。但熱變性方法亦存在缺陷，在熱變性過程中蛋白質(zhì)易 聚集，因此而未能被廣泛采用。

因此，本領(lǐng)域目前使用的方法均存在技術(shù)上的缺陷，且無法滿足蛋白質(zhì)組 學(xué)高通量的分析要求，因此本領(lǐng)域迫切需要找到一種高效快速酶解、鑒定蛋白 的方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種快速酶解混合蛋白質(zhì)的方法。

在本發(fā)明的第一方面，提供一種快速酶解蛋白質(zhì)(特別是混合蛋白質(zhì))的方 法，所述的方法包括：

(1)提供待酶解的蛋白質(zhì)樣品；

(2)將步驟(1)獲得的待酶解的蛋白質(zhì)樣品進行變性處理，獲得經(jīng)變性的蛋白 質(zhì)樣品；和

(3)對步驟(2)獲得的經(jīng)變性的蛋白質(zhì)樣品進行蛋白酶酶解處理，并輔以超聲 波處理，獲得蛋白質(zhì)多肽片段。

在另一優(yōu)選例中，所述的待酶解的蛋白質(zhì)樣品中含有一種或多種蛋白質(zhì)(即混 合蛋白質(zhì))。更佳地，所述的待酶解的蛋白質(zhì)樣品中含有的多種蛋白質(zhì)具有某一范 圍的pI值(即接近的pI值)。

在另一優(yōu)選例中，所述的超聲波處理是間歇式或連續(xù)進行。

在另一優(yōu)選例中，步驟(2)中，將待酶解的蛋白質(zhì)樣品先進行還原和烷基化處 理，再進行熱變性，從而獲得變性的蛋白質(zhì)樣品。

在另一優(yōu)選例中，在進行還原和烷基化處理時，分別采用二硫蘇糖醇(DTT) 和碘乙酰胺(IAA)處理所述的蛋白質(zhì)樣品。

在另一優(yōu)選例中，二硫蘇糖醇在樣品中的終濃度是5-20mmol/L；碘乙酰胺在 樣品中終濃度約是二硫代蘇糖醇的5倍。

在另一優(yōu)選例中，在進行還原和烷基化處理時，進行超聲波(優(yōu)選超聲浴)輔 助處理。

在另一優(yōu)選例中，在還原和烷基化處理時，采用連續(xù)超聲波處理方式。

在另一優(yōu)選例中，二硫蘇糖醇處理時，在37±2℃下超聲波輔助處理5±2分 鐘。較佳地，超聲功率是5-100瓦。較佳地，超聲頻率10-50MHz(較佳的為 20-30MHz)。

在另一優(yōu)選例中，碘乙酰胺處理時，在室溫黑暗條件下超聲波輔助處理5±2 分鐘。較佳地，超聲功率是5-100瓦。較佳地，超聲頻率10-50MHz(較佳的為 20-30MHz)。

在另一優(yōu)選例中，步驟(2)中，在進行熱變性時，調(diào)節(jié)蛋白樣品的pH值遠離 樣品蛋白質(zhì)的等電點。

在另一優(yōu)選例中，熱變性的條件是：85-95℃處理(優(yōu)選水浴處理)10-20分鐘。

在另一優(yōu)選例中，步驟(3)中，所述的蛋白酶選自(但不僅限于)下組的一種或 多種酶：胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、內(nèi)肽酶Lys-C、V8蛋白酶、梭菌蛋白酶。