[發(fā)明專利]一種同時(shí)測定人血漿中霉酚酸酯、霉酚酸及其代謝物的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200810202400.5
• 申請日: 2008-11-06
• 公開（公告）號: CN101419224A
• 公開（公告）日: 2009-04-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 道毅俊;焦正;施孝金;李中東;鐘明康
• 申請（專利權(quán)）人: 復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院
• 主分類號: G01N33/48
• 分類號: G01N33/48;G01N30/02;G01N21/64
• 代理公司: 上海正旦專利代理有限公司
• 代理人: 包兆宜

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域，涉及體內(nèi)藥物的分析測定方法，具體涉及一種測 定人血漿中霉酚酸酯、霉酚酸及其代謝物的方法。

背景技術(shù)

臨床器官移植后需進(jìn)行抗排異治療，目前廣泛采用新型的抗代謝類免疫抑制 劑霉酚酸酯(Mycophenolate?Mofetil，MMF，RS61443；商品名：Cellcept，驍悉) 進(jìn)行抗排異治療。該藥物是霉酚酸(Mycophenolic?Acid，MPA)的2-乙基酯前體 藥物，可顯著提高M(jìn)PA的體內(nèi)生物利用度。MMF口服后，在體內(nèi)迅速被水解 脫酯轉(zhuǎn)化為活性代謝產(chǎn)物MPA，后者繼而與葡萄糖醛酸結(jié)合，轉(zhuǎn)化為沒有活性的 代謝產(chǎn)物葡糖苷酸化物(Mycophenolic?acid?glucuronide，MPAG)，其主要代謝途 徑如圖1所示。MPAG在體內(nèi)的濃度大大高于MPA，且能通過腸肝循環(huán)再次水 解為MPA，重新進(jìn)入體內(nèi)發(fā)揮作用，因此MPAG能夠影響MPA的體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)。 現(xiàn)有技術(shù)研究表明，MMF在部分病人中的生物利用度低于80％，甚至低于50％， 不完全的生物轉(zhuǎn)化同樣可能影響MPA的藥動(dòng)學(xué)。所以，通過同時(shí)測定血漿中三 種物質(zhì)的濃度，并據(jù)此調(diào)整給藥劑量，對保證用藥的安全和療效有重要意義。

與本發(fā)明相關(guān)的現(xiàn)有技術(shù)有專利：ZL?200410066519.6，但其中公開的技術(shù)方 案所能測定的藥物范圍仍嫌不足。迄今為止，尚未見國內(nèi)、外有關(guān)同時(shí)測定人血 漿中MMF、MPA和MPAG的濃度的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足缺陷，提供一種簡便、快速、靈敏、 可同時(shí)測定人血漿中霉酚酸酯(Mycophenolate?Mofetil，MMF，RS61443；商品名： Cellcept，驍悉)，霉酚酸(Mycophenolic?Acid，MPA)和代謝產(chǎn)物葡糖苷酸化物 (Mycophenolic?acid?glucuronide，MPAG)濃度的方法。本方法具有操作簡便、快速、 血漿用量少、成本低等優(yōu)點(diǎn)，無需昂貴的設(shè)備和試劑，更適合臨床常規(guī)監(jiān)測和藥 動(dòng)學(xué)研究。

本方法的技術(shù)方案是：待測樣品預(yù)處理后，先用紫外檢測器檢測MPAG，然 后利用MMF和MPA在堿性條件下有強(qiáng)的熒光吸收的特征，在分析色譜柱分離 后在線衍生化(堿化)，用熒光檢測器檢測。該法可使MMF和MPA的檢出靈敏度 大大提高。

本方法包括以下步驟：

1)樣品預(yù)處理

取待測樣品，加入甲醇、乙腈或兩者混合液，進(jìn)行蛋白沉淀；離心后取上清 液進(jìn)樣；

2)樣品分離

采用通用型的液相色譜柱，其填料為十八烷基或辛烷基鍵合相硅膠，高 效液相系統(tǒng)采用通用型的紫外和熒光檢測器以及高壓泵，流動(dòng)相采用等度洗 脫；分別采用紫外和熒光檢測器分別檢測MPAG，MMF和MPA的峰面積，用 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程換算成三者的濃度；其中色譜條件是，HPLC系統(tǒng)：日本島津 公司LC-10A高效液相儀(系統(tǒng)包括雙泵，紫外檢測器和熒光檢測器，)；色譜 柱：ZORBAX?RX-C8(250mm×4.6mm，5μm)；流動(dòng)相：采用等度洗脫， 甲醇—0.1％TFA(60:40-50:50，V/V)；流速：1.0-1.2ml/min；柱溫40-45℃； 熒光激發(fā)波長342-344nm，發(fā)射波長425-427nm。

3)樣品柱后衍生化

采用附加一個(gè)高壓泵和一個(gè)三通連接柱后衍生化試劑，并用串聯(lián)方式連接紫 外檢測器和熒光檢測器，使分離后的樣品有熒光信號。

本方法用于同時(shí)定量測定人血漿中MMF、MPA和MPAG的濃度：首先定 量分取血漿樣品，加入定量的蛋白沉淀劑，混勻、離心，取上清液進(jìn)樣，經(jīng)紫外 檢測器檢測MPAG，再用NaOH或KOH溶液進(jìn)行衍生化后，用熒光檢測器檢測 MMF和MPA。

上述測定方法中，加入的蛋白沉淀劑為甲醇、乙腈或二者混合物。

上述測定方法中，分別用紫外檢測器和熒光檢測器測定MPAG，MMF和MPA 的峰面積，用標(biāo)準(zhǔn)曲線方程換算成MPAG，MMF和MPA的濃度。上述方法中， 采用通用型的液相色譜柱，其填料為十八烷基或辛烷基鍵合相硅膠為填料的液相 色譜柱。高效液相系統(tǒng)采用通用型的紫外和熒光檢測器以及高壓泵，流動(dòng)相采用 等度洗脫。