[發(fā)明專利]一種血小板生成素模擬肽、制備及其應(yīng)用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200810200739.1
• 申請日: 2008-09-28
• 公開（公告）號: CN101362797A
• 公開（公告）日: 2009-02-11
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張緒瑛;吳自榮;劉雯;黃靜;孫昭;汪洋
• 申請（專利權(quán)）人: 華東師范大學(xué)
• 主分類號: C07K7/08
• 分類號: C07K7/08;C07K1/20;C07K1/06;C07K1/04;A61K38/10;A61P7/00
• 代理公司: 上海德昭知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司
• 代理人: 程宗德

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種血小板生成素模擬肽及其制備和其在升高外周血血小板數(shù)及在制備治療血小板減少癥的藥物中的用途，使用該模擬肽可以有效的升高外周血中血小板的數(shù)目，并可治療多種原因引起的血小板減少癥。屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

血小板減少癥是一種常見的血液病，是臨床上治療惡性血液疾病和腫瘤中遇到的重要問題之一，當腫瘤患者受到集中的化療和放療后，骨髓都將受到不同程度的抑制。骨髓抑制及其并發(fā)的貧血、粒細胞減少和血小板減少是造成患者死亡的主要因素，也是臨床上限制放、化療劑量，提高療效的主要障礙。當人血小板計數(shù)在20×10⁹/L以下時，極易發(fā)生顱內(nèi)出血、內(nèi)臟大出血等致命性出血。目前，血小板輸注是嚴重血小板減少癥的標準治療方法，對骨髓抑制治療所導(dǎo)致的一過性血小板減少癥療效肯定。

盡管血小板輸注療效肯定，但血小板保存時間短、供血來源缺乏、花費較高且可能發(fā)生同種異體免疫反應(yīng)、感染、輸血相關(guān)移植物抗宿主病(GVHD)等，從而限制了血小板輸注的臨床應(yīng)用。目前臨床上已用重組的EPO、GCSF、GM-CSF改善由于化療引發(fā)的貧血和粒細胞減少，然而目前還沒有一種能有效改善放化療后血小板減少的藥物。

血小板生成素(thrombopoietin，TPO)是作用于巨核細胞系分化發(fā)育的特異性造血因子，是最早階段巨核細胞和血小板分化發(fā)育最重要的生理性調(diào)節(jié)因子。[Promotion?of?megakaryocytop?rogenior?expansion?and?differentiation?by?the?c-Mp?1ligand?thrombopoietin.Nature，1994，369：568～571.]TPO是目前發(fā)現(xiàn)的唯一全程參與巨核細胞增殖和分化的最基本的生長因子。TPO可顯著減輕和縮短接受骨髓抑制性治療的小鼠所出現(xiàn)的血小板減少癥的程度和時間，作用與劑量相關(guān)，未見嚴重副反應(yīng)發(fā)生，血小板形態(tài)和功能未見異常。盡管在正常動物體內(nèi)TPO主要影響血小板生成，但在骨髓抑制狀況下對紅細胞和中性粒細胞生成也有促進作用，并和G-CSF有協(xié)同效應(yīng)。鑒于腫瘤化療常引起多種血細胞減少，造成嚴重副作用，TPO與其它造血因子(如G-CSF)合并使用可有效地加快骨髓恢復(fù)，從而支持大劑量化療，提高抗腫瘤療效。

TPO模擬肽是與TPO具有相似功能但不具同源結(jié)構(gòu)的小分子物質(zhì)，因活性高、開發(fā)代價小、且不具免疫原性等優(yōu)點而受到青睞。1997年，Cwirla等從絲狀噬菌體展示肽庫中篩選到高活性的TPO模擬肽AF?12505。該14肽為線性肽，結(jié)構(gòu)式為IEGPTLRQWLAARA，具有刺激TPO依賴性細胞株Ba/F3-mpl的增殖功能，EC₅₀為400nmol/L[Peptide?agonist?of?the?thrombopoietin?receptor?aspotient?as?the?nature?cytokine.Science，1997，276：1696.]。但是，該結(jié)構(gòu)的活性肽存在生物學(xué)活性偏低，半衰期短的不足，難以滿足實際需要。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的第一個目的是提出一種新型的活性提高的血小板生成素模擬肽，該模擬肽的分子結(jié)構(gòu)為：

該模擬肽在AF?12505的氨基酸序列兩端添加半胱氨酸，利用兩個半胱氨酸殘基形成二硫鍵，將線性肽轉(zhuǎn)變?yōu)榄h(huán)肽，期望在保留AF?12505與受體高親和性的基礎(chǔ)上，利用環(huán)肽的穩(wěn)定性，增強該模擬肽的半衰期，從而提高其生物活性。該新型模擬肽具有明顯的升高外周血血小板數(shù)目的活性，可以治療由放化療引起的血小板減少癥，具有良好的臨床使用價值。

本發(fā)明的第二個目的是提供上述模擬肽的制備方法。該模擬肽可通過固相化學(xué)合成方法制備，技術(shù)成熟，成本低，適宜普及使用。

固相化學(xué)合成法在制備少于40個氨基酸的小肽工藝十分成熟，具有快速、純化簡便、成本低等優(yōu)點。本發(fā)明的技術(shù)方案選用固相化學(xué)合成法按該模擬肽的氨基酸序列合成線性肽，再用氧化劑氧化兩端的半胱氨酸形成二硫鍵，從而獲得環(huán)肽。其中，氧化劑可選用鐵氰化鉀、碘、三氟乙酸鉈、DMSO等，本發(fā)明優(yōu)選DMSO氧化法。

現(xiàn)詳細說明本發(fā)明的技術(shù)方案。

一種血小板生成素模擬肽的固相化學(xué)合成方法，其特征在于，具體操作步驟：