[發明專利]一種豬氟烷基因基因型的檢測方法

無效

• 申請號: 200810200152.0
• 申請日: 2008-09-19
• 公開（公告）號: CN101358245A
• 公開（公告）日: 2009-02-04
• 發明（設計）人: 李建穎;劉煒;吳昊旻;馬芳芳;黃國慶
• 申請（專利權）人: 上海市動物疫病預防控制中心
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11;G01N21/64
• 代理公司: 上海申匯專利代理有限公司
• 代理人: 林煒

技術領域：

本發明屬于生物工程領域，尤其涉及一種基因檢測方法，特別涉及一種豬氟烷基因基因型的檢測方法，具體來說是一種應用熒光定量PCR技術檢測豬氟烷基因不同基因型的方法。

背景技術：

豬氟烷基因又稱骨骼肌鈣離子釋放通道基因或蘭尼定受體基因，由一對等位基因Hal^N和Halⁿ組成，并構成Hal^NN(野生型)、Hal^Nn(雜合型)和Halⁿⁿ(突變型)3種基因型，是導致豬應激綜合癥的一個主效基因，豬應激綜合癥的典型癥狀為豬惡性高熱、肌肉強直、突然死亡，以及屠宰后肉質變差，形成劣質肉。由于豬應激綜合癥產生的豬應激死亡、劣質肉已給世界各國的養豬生產和豬肉的銷售加工造成了巨大損失，因此，需要通過檢測來分辨并剔除豬群中氟烷基因的Halⁿ基因，以避免豬應激綜合癥的產生。目前檢測豬氟烷基因的方法主要有生理、生化和分子生物學檢測。生理檢測是使幼豬吸入一定濃度的氟烷氣體被麻醉后，表現出肌肉痙攣、四肢僵直的為氟烷陽性(Halⁿⁿ)，未出現任何癥狀、四肢松軟的為氟烷陰性(Hal^NN)或雜合子(Hal^Nn)。此法簡單易操作，但檢測準確性不高，且只能檢出氟烷陽性。生化檢測是通過檢測豬血液中氟烷基因連鎖的酶或血型基因來間接選擇基因型，此方法準確性較高，但豬不同品種、品系間連鎖群關系有差異，且與氟烷基因位點間有互換，使此法的應用受到很大限制；目前最為常用的是分子生物學檢測方法。文獻記載的豬氟烷基因分子生物學檢測方法為普通聚合酶鏈式反應法(polymerase?chain?reaction?PCR)，主要有限制性酶切片段長度多態性分析法(restriction?fragment?lengthpolymorphism?PCR-RFLP)和一步PCR法。PCR-RFLP法使用一對引物進行普通PCR擴增，然后對擴增產物進行限制性酶切，凝膠電泳，根據電泳條帶的差異來判斷基因型。該方法操作步驟多，過程復雜，耗時較長，酶切的完全與否直接影響對結果的判斷，酶切的程度也較難控制，不同產物、不同內切酶的酶切時間都不相同，因此要求實驗操作者具有豐富經驗。一步PCR法，該法使用兩對引物在一個反應體系中進行普通PCR擴增，不同的基因型可以得到不同的PCR擴增產物，然后制作凝膠，電泳PCR產物判斷基因型。相對PCR-RFLP方法，該方法不需要酶切，操作相對簡單，但由于使用兩對引物擴增產物，容易對PCR擴增效率和結果的判斷產生不利影響。另外，以上兩種方法都需要制作凝膠，使操作人員接觸有毒有害試劑；電泳的電流強度與時間難以控制，容易電泳失敗，導致條帶無法看清而影響基因型的判定。

發明內容：

本發明所要解決的技術問題是提供一種豬氟烷基因基因型的檢測方法，所述的這種豬氟烷基因基因型的檢測方法要解決現有技術中的檢測豬氟烷基因基因型的方法準確率低、操作步驟多、過程復雜、時間長、檢測試劑有毒的技術問題。

本發明是一種豬氟烷基因基因型的檢測方法，其特征在于包括如下步驟：

a)對豬氟烷基因進行PCR擴增，然后對擴增出的堿基片段進行堿基測序，確定豬氟烷基因的突變位點，根據突變位點兩端的堿基序列設計兩組引物，其中一組引物的上游引物3’端和野生型的基因位點匹配，另一組引物的上游引物3’端和突變型的基因位點匹配，兩組的下游引物相同；

b)將待檢測豬的樣品DNA分別與野生型引物、突變型引物在兩個反應體系中同時進行PCR擴增，擴增后每個樣品與每組引物產生一個熒光信號，即每個樣品產生兩個熒光信號，隨著PCR反應的進行，PCR反應產物不斷累計，熒光信號強度也等比例增加，每經過一個循環，收集一次熒光信號，通過熒光信號的強度變化監測產物量的變化，從而得到一條熒光信號強度曲線圖，根據兩個熒光信號的增強先后次序即可得出豬氟烷基因的基因型。

進一步的，所述的野生型的基因位點的上游引物為5’CAA?TGG?TGT?GGCCGT?GT?3’，野生型基因位點的下游引物為5’GCC?CAG?ACC?TGG?TGA?CAT?A3’，突變型基因位點的上游引物為5’CAA?TGG?TGT?GGC?CGT?GC?3’，突變型基因位點的下游引物為5’GCC?CAG?ACC?TGG?TGA?CAT?A?3’。