[發(fā)明專利]一種利用微生物轉(zhuǎn)化制備人參皂苷Rd的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200810200086.7
• 申請日: 2008-09-18
• 公開（公告）號: CN101676402A
• 公開（公告）日: 2010-03-24
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 周珮;史訓(xùn)龍;馮美卿;周超群;黃維;方平;孫宇;張亞麗
• 申請（專利權(quán)）人: 上海海泰藥業(yè)有限公司
• 主分類號: C12P33/00
• 分類號: C12P33/00;C12R1/79
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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用微生物轉(zhuǎn)化制備人參皂苷Rd的方法。

背景技術(shù)

人參皂苷Rd對心血管，免疫系統(tǒng)，神經(jīng)系統(tǒng)等具有良好的藥理作用，有些藥理作用是人參皂苷Rd獨(dú)有而其他的單體皂苷沒有的生物活性。

人參皂苷Rd在人參中含量較低，只有0.2％左右，因其結(jié)構(gòu)復(fù)雜，化學(xué)合成至今尚未成功，目前從人參、三七等植物根、莖、葉中提取來獲得Rd單體，提取方法由于其收率低，成本較高，影響了醫(yī)療保健市場需求的進(jìn)一步擴(kuò)大，因此有必要開發(fā)一種產(chǎn)率高，純度好，并且簡單易行的制取人參皂苷Rd的方法。

對比相對含量較高的人參皂苷Rb1，Rb2，Rc等主要皂苷，人參皂苷Rd的差別在于20位糖鏈末端的糖苷鍵(圖1)。理論上可以通過這些糖基的水解得到人參皂苷Rd。目前有研究試圖利用加熱、酸水解法、堿水解法等化學(xué)方法將主要皂苷轉(zhuǎn)化為活性更高的稀有皂苷。但是這些化學(xué)水解條件都十分劇烈，不易控制，而且在水解過程中能使皂苷元發(fā)生脫水、環(huán)合、差向異構(gòu)、羥化等反應(yīng)，產(chǎn)生較多副產(chǎn)物，很難得到目標(biāo)產(chǎn)物。生物轉(zhuǎn)化的區(qū)域和立體選擇性強(qiáng)、反應(yīng)條件溫和，這就使得酶轉(zhuǎn)化法和微生物轉(zhuǎn)化法制備稀有人參皂苷受到青睞。

從動物代謝來看，人參皂苷Rd可以由主要皂苷Rb1代謝而來，與其它皂苷不同的是，在胃中并不能由人參皂苷Rb1水解得到人參皂苷Rd，也不能由腸道菌分解得到人參皂苷Rd，人參皂苷Rd主要通過腸道酶水解得到。目前只有利用微生物來源的酶轉(zhuǎn)化得到人參皂苷Rd的研究報道，這些研究中轉(zhuǎn)化過程中存在轉(zhuǎn)化產(chǎn)物不專一以及人參皂苷對酶的明顯抑制，而且轉(zhuǎn)化底物采用的都是高純度的Rb1，導(dǎo)致這些轉(zhuǎn)化方法酶用量大，在加上底物成本高，對工業(yè)化生產(chǎn)造成極大限制。

由于酶轉(zhuǎn)化法應(yīng)用困難，使得微生物轉(zhuǎn)化法制備Rd單體更有研究價值和應(yīng)用前景，但是迄今為止還沒有利用微生物發(fā)酵專一性制備人參皂苷Rd的報道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供一種利用微生物轉(zhuǎn)化制備人參皂苷Rd的方法，包含下列步驟：

a)人參皂苷加入培養(yǎng)液中，接種擬青霉菌(Paecilomyces?sp)進(jìn)行發(fā)酵反應(yīng)；

b)收獲菌體，菌體加入醇液提取，獲得醇提取液；

c)飽和正丁醇萃取醇提取液；

d)層析柱分離、純化。

在一優(yōu)選實(shí)施例中，所述擬青霉菌為人參皂苷耐受性高的擬青霉菌Paecilomyces?sp.4685，能進(jìn)行微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)，并使主要產(chǎn)物停留在Rd。本發(fā)明所述的擬青霉菌Paecilomyces?sp.4685可以從中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心獲得。

在優(yōu)選實(shí)施例中，所述人參皂苷來源于人參、紅參、白參、尾參、人參葉或人參花蕾以及同屬的植物根、莖、葉。

在優(yōu)選實(shí)施例中，所述人參皂苷的投料量為培養(yǎng)液重量的0.5-7％，其中優(yōu)選1％-2％。

在優(yōu)選實(shí)施例中，所述醇液選自甲醇或乙醇。

在優(yōu)選實(shí)施例中，所述培養(yǎng)液中碳源選自葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、馬鈴薯或淀粉中之一或任何組合，其中優(yōu)選淀粉。

在優(yōu)選實(shí)施例中，所述培養(yǎng)液中遲效氮源選自玉米漿，棉籽粉，酵母粉，黃豆粉，蛋白胨，花生粉中之一或任何組合，其中優(yōu)選棉籽粉。

在優(yōu)選實(shí)施例中，所述培養(yǎng)液中速效氮源選自尿素，硝酸鈉，氯化銨，硫酸銨，硝酸鉀，醋酸銨中之一或任何組合，其中優(yōu)選硝酸鈉。

在優(yōu)選實(shí)施例中，所述培養(yǎng)液包含淀粉2-4％，棉籽粉2-4％，硝酸鈉0.05-0.2％，硫酸鎂0.05-0.2％，氯化鈣0.05-0.2％，麩皮0.1-1％。

在優(yōu)選實(shí)施例中，所述培養(yǎng)液的pH值為pH4-8，其中優(yōu)選pH?5。

在優(yōu)選實(shí)施例中，所述層析柱的填料為大孔吸附樹脂。

本發(fā)明所公開的方法轉(zhuǎn)化率高，其轉(zhuǎn)化率能保持在70-90％，發(fā)酵產(chǎn)物人參皂苷Rd的純度為98％，能夠?qū)崿F(xiàn)人參皂苷Rd的微生物產(chǎn)業(yè)化制備，擴(kuò)充人參皂苷Rd藥物資源來源，滿足廣闊的醫(yī)療保健的市場需要都有極大價值。

附圖說明

圖1.人參皂苷Rd的轉(zhuǎn)化途徑示意圖。

圖2.碳源對轉(zhuǎn)化效果的影響。

圖3.遲效氮源對轉(zhuǎn)化效果的影響。

圖4.底物投料量對轉(zhuǎn)化效果的影響。

圖5.轉(zhuǎn)化時間對轉(zhuǎn)化效果的影響。

圖6.pH值對轉(zhuǎn)化效果的影響。

圖7.底物和產(chǎn)物的HPLC檢測圖。

具體實(shí)施方式