[發明專利]一種應用懸浮芯片技術檢測宋內志賀氏菌方法

無效

• 申請號: 200810181200.6
• 申請日: 2008-11-27
• 公開（公告）號: CN101440404A
• 公開（公告）日: 2009-05-27
• 發明（設計）人: 王景林;趙金銀;高姍;劉艷華;康琳
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事醫學科學院微生物流行病研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;G01N21/64
• 代理公司: 暫無信息
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技術領域

本發明涉及一種分子生物學檢測芯片，具體的是一種應用懸浮芯片技術對宋內志賀氏菌進行檢測。

背景技術

懸浮芯片技術是將基因芯片技術與流式細胞儀技術結合產生的一種新技術，是一種多重數據獲取和分析平臺，全名為“多功能多指標同步分析體系”(Flexible?Multiple?Analyte?Profiling，xMap)，也稱為Multi-Analyte?SuspensionArray，有機整合了熒光編碼微球、激光技術、微流體技術、快速信號處理和數據分析系統，即保證了信號質量，又提供高通量的新一代分子檢測技術平臺。懸浮芯片與傳統的基因芯片最大不同之處在于，傳統的基因芯片點樣在玻片或尼龍膜上，依靠坐標定位進行尋址，而懸浮芯片將檢測探針共價交聯到不同的色標微球上，根據色標微球上所帶的熒光素進行區分。

懸浮芯片系統主要由三部分組成：1、微球直徑5.6μm左右，由聚苯乙烯構成的，表面帶有約10⁸個羧基位點，可與寡核苷酸探針和蛋白以肽鍵耦聯；2、熒光素微球中標記了紅色和橙色熒光素，每種分成10個濃度梯度，將微球分成可被識別的100種微球，當微球被635nm激光激發后，能發射658nm和712nm的熒光；3、檢測儀因微球直徑5.6μm，并被熒光標記，采用流式細胞儀技術原理進行檢測。

原理：每一種色標微球可通過羧基，與特定的分析物質(寡核苷酸探針、抗原、抗體等)共價結合。將標記生物探針的微球與待測物進行特異性的結合，再和帶有第三種熒光素的報告分子反應，在一個反應孔內可同時對一個樣本中的100種不同目的分子進行檢測。反應后，采用96孔板進行進樣。檢測儀自動將反應液吸起加入蠕動泵，泵入一個微細管中，在鞘液的作用下，單排分布的微球單個通過檢測通道。檢測通道中設有兩個激光探頭，一個探頭可發射635nm波長的激光，可激發標記微球的兩種熒光素，從而識別不同的色標微球，進行定性檢測；另一激光探頭可激發報告分子的熒光素，通過測定微球所帶報告分子熒光信號的強度，可進行定量檢測。因此，懸浮芯片可進行定性定量檢測目標分子。當樣本中含有目的分子，目的分子與特定的微球所帶的探針吸附在一起時，兩道激光所激發的熒光均可被檢測到；若樣本中不含目的分子，則僅能檢測到微球所帶的熒光。通過數字信號處理器與計算機自動統計軟件，分析兩道激光所激發熒光的波長和信號強度，從而判斷待檢樣本中幾種至數十種檢測目標物，并通過檢測熒光信號強度，對檢測物進行定量分析。自動加樣器依次將不同樣本加入蠕動泵中，樣本之間用一小段氣柱分隔開，這樣在連續分析過程中不但可以區分不同樣本，可還以防止樣本間的污染。

與其它蛋白質和核酸檢測方法相比較，懸浮芯片具獨特優點：

1)應用范圍廣微球表面的羧基可與核酸探針和蛋白分子耦聯，能對目的核酸和蛋白分子進行定性定量研究；

2)敏感性高以微球作為反應載體，增加了反應物接觸面積；每個微球表面帶有約10⁸個羧基位點，以共價鍵方式耦聯寡核苷酸探針、抗體或抗原，探針密度高，產生的信號強；使用熒光檢測，放大了反應信號，敏感性大大提高。

3)重復性好所進行的生物反應是在液相環境中進行的，利于保持核酸、蛋白等生物分子天然構象，克服了傳統芯片空間效應的影響，也更利于探針和被檢物質的反應，提高了檢測的準確性；

4)信噪比低在微細管中對單個微球進行檢測，不存在本底影響檢測的問題，無需洗脫去除本底；

5)高通量可以同時對同一樣本中的多重不同目的分子進行定性定量分析，即提高了檢測信息通量，又節約了樣本用量；

6)快速高效大大提高了反應速度和檢測速度。由于所進行的生物反應是在液相環境中進行的，雜交僅需15分鐘即可完成，提高了反應速度；在35—60分鐘內，可對96個不同樣本分別同時進行多達100種指標的檢測；利用96孔板和自動進樣系統，可連續進行n×96個樣品的檢測。

7)成本低制備過程無需特殊設備，只進行羧基與氨基間的脫水成肽反應即可，簡單易行；由于是液體儲存方式，一次制備可多次使用，平均每個指標檢測成本僅需2.5—5.0元；

8)易于標準化基于上述特點，使得該技術能夠做到標準化，易于試劑盒的研制和推廣。目前，懸浮芯片是美國FDA唯一批準用于臨床診斷(自身免疫病檢測和人類白細胞抗原分型)的生物芯片。