[發明專利]淋巴囊腫病毒的快速檢測試劑盒及其檢測方法

無效

• 申請號: 200810160300.0
• 申請日: 2008-11-19
• 公開（公告）號: CN101550456A
• 公開（公告）日: 2009-10-07
• 發明（設計）人: 岳志芹;梁成珠;李瓊;陳曉;鄭小龍;賈俊濤;朱來華;張健;趙巍;鄧明俊;肖西志;辛學謙
• 申請（專利權）人: 山東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68
• 代理公司: 青島海昊知識產權事務所有限公司
• 代理人: 張中南

技術領域

本發明屬于水產動物病原的檢測技術，具體是一種采用環介導等溫擴增技術對魚類淋巴囊腫病毒進行快速檢測的試劑盒及其檢測方法。

背景技術

淋巴囊腫病毒(Lymphocystis?disease?virus，簡稱LCDV)屬于虹彩病毒科，淋巴囊腫病毒屬，可感染9目34科計140種以上魚類，是對魚類危害較為嚴重的病毒病之一，其感染率達80％，死亡率達30％。患病魚在口唇、鰓、鰭、尾及體表等處散布大小不一的單個或成群的腫瘤，失去商品價值。淋巴囊腫病毒給水產養殖業帶來巨大的損失，同時嚴重影響經濟魚類的進出口貿易。中國國家質量監督檢驗檢疫總局與韓國海洋水產部于2005年發布的《中韓進出口活水生動物檢驗檢疫協議》中規定，中國出口到韓國的鱸魚、真鯛、大菱鲆、牙鲆等魚類必須進行淋巴囊腫病毒的檢驗檢疫。

目前魚類病毒的檢測方法主要包括細胞學診斷技術、免疫學診斷技術、分子生物學診斷技術三大類。細胞學診斷技術主要包括采用細胞培養分離病毒、組織病理切片及電鏡觀察，其操作繁瑣，檢測周期長，且靈敏度低；免疫學診斷技術主要包括免疫熒光檢測、免疫點雜交，其方法具有特異性強、敏感性高的優點，但方法相當繁瑣，不適宜對大量樣品進行檢測；分子生物學診斷技術主要包括聚合酶鏈式反應(PCR)，比較快速、靈敏，但是需要昂貴的PCR儀器，另外需要瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色觀察結果，溴化乙錠是致癌物，對人體和環境有危害，交叉污染問題比較嚴重。

水產養殖業和國際魚類貿易的發展迫切需要建立快速、靈敏、準確的淋巴囊腫病毒的檢測方法，打破國外技術壁壘，為國家貿易服務。環介導等溫擴增(Loop-Mediated?Isothermal?Amplification，簡稱LAMP)技術，是一種敏感性高、特異性強的靶DNA快速檢測方法，不需要昂貴的儀器，樣品中含有少量的病原就能檢出。環介導等溫擴增目前已被廣泛應用于檢測水產動物的病原體，如魚類的鯉春血癥病毒、傳染性胰臟壞死病毒；對蝦的病毒白斑綜合癥病毒、黃頭病毒；細菌中的遲鈍愛德華氏菌等。據檢索，目前尚未見采用環介導等溫擴增技術對淋巴囊腫病毒進行快速檢測的報道。

發明內容

本發明的目的是提供一種利用環介導等溫擴增技術檢測淋巴囊腫病毒的檢測試劑盒，克服現有技術的不足，以滿足現場即時檢測的要求。

本發明的另一目的是提供魚類淋巴囊腫病毒的檢測方法，以方便在水產養殖業和國際魚類貿易中對淋巴囊腫病毒進行快速檢測中的應用。

本發明的主要原理為：LAMP技術是使核酸通過在等溫環境中的循環置換擴增實現對靶序列的放大，從而達到檢測的目的。基本程序是針對靶基因的6個區域，設計2對特異性引物，同時可以設計1-2條環引物以加快反應速度，利用一種鏈置換脫氧核糖核酸聚合酶(Bacillus?stearothermophilus?DNApolymerase，簡稱BstDNA聚合酶)，在恒溫65℃左右反應1h。BstDNA聚合酶有兩大特性：一是具有5′-3′聚合酶活性，能在恒溫狀態下擴增DNA核酸；二是Bst?DNA聚合酶具有鏈置換活性，能將新合成的核酸單鏈從新生成的DNA雙鏈上置換(取代)下來，形成兩條獨立的核酸單鏈以開啟下一輪的DNA核酸合成，進而免去了每次擴增前的DNA變性環節。LAMP反應過程中，一對引物的5′端含有一段與下游擴增產物互補的序列，因此，這對引物的單鏈產物就可形成一個類似啞鈴狀的回文結構，這種結構正好為下一步等溫置換擴增反應提供了一個可被周而復始利用的模板，Bst?DNA聚合酶發揮鏈置換活性，后階段退火的引物置換前面引物所形成的鏈，從而保證了擴增的持續進行。LAMP反應形成一系列不同長度的具有莖環結構的DNA產物，可以通過熒光染料進行檢測。

本發明的技術方案如下：

淋巴囊腫病毒的環介導等溫擴增快速檢測試劑盒，包括提供反應必須的Bst?DNA聚合酶、逆轉錄酶、反應緩沖液、環介導等溫擴增混合液、引物混合液和熒光顯色劑，以及提供一種使用該試劑盒檢測魚類樣品中淋巴囊腫病毒的方法，以實現對淋巴囊腫病毒快速檢測的標準化，為魚類淋巴囊腫病毒的檢測提供一種快速、簡便、高效、實用的檢測方法。

本發明的淋巴囊腫病毒的環介導等溫擴增快速檢測試劑盒的配方如下：

試劑A：Bst?DNA聚合酶，每μL含8個活性單位(8U/μL)；