[發(fā)明專利]產(chǎn)毒素B艱難梭菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增快速檢測方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200810157902.0
• 申請日: 2008-10-15
• 公開（公告）號: CN101402998A
• 公開（公告）日: 2009-04-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 雷質(zhì)文;賀楠;馬維興;祝素珍;張健;姜英輝;李正義;房保海;唐靜;賈俊濤;劉云國;趙麗青
• 申請（專利權(quán)）人: 山東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 青島海昊知識產(chǎn)權(quán)事務(wù)所有限公司
• 代理人: 張中南

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種利用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)技術(shù)進(jìn)行菌樣的快速檢測的方 法，具體是一種產(chǎn)毒素B艱難梭菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增快速檢測方法。

背景技術(shù)

艱難梭菌(Clostridium?difficile)是梭菌屬的一個成員，二十世紀(jì)九十年代以 來成為最重要的醫(yī)院感染的病原之一。艱難梭菌屬厭氧性細(xì)菌，就是指那些在無 氧條件下要比在有氧環(huán)境中生長好的細(xì)菌，而人的腸道正好是一個相對無氧的環(huán) 境。艱難梭菌廣泛分布于自然生境中，如土壤、干草、沙、一些大型動物(牛、 驢和馬)的糞便，及狗、貓、嚙齒動物和人的糞便，嬰兒的糞便中常含有艱難梭 菌，大約50％12月齡嬰兒的腸道中有艱難梭菌，2歲以上兒童的帶菌率大約為3％， 但此菌在健康成人中出現(xiàn)頻率較低，無癥狀帶菌的成人在瑞典是1.9％，在日本為 15.4％。艱難梭菌芽孢菌的細(xì)菌平時寄生在人類腸道中，如果過量服用抗生素致 使菌群增長速度過快，就會引發(fā)嚴(yán)重的炎癥。一份報(bào)告以加拿大魁北克地區(qū)舉例， 12家醫(yī)院中1703名病人的病歷都顯示這種病菌具有高致命性。近期的研究表明，艱 難梭菌是腸道感染中第二位常見致病菌，僅次于彎曲菌屬，易引起以發(fā)熱、腹痛、 水樣瀉及偽膜性腸炎。艱難梭菌之所以能夠致病，是因?yàn)樗哂?種毒力因子：毒 素A、毒素B和一種能夠抑制腸道蠕動的物質(zhì)。毒素A有腸毒性，毒素B有細(xì)胞毒性。 毒素A也有一定的細(xì)胞毒性作用，但比毒素B小。毒素A和B是艱難梭菌的主要致病 因子，可干擾腸道上皮細(xì)胞的肌動蛋白骨架，使細(xì)胞喪失功能。

現(xiàn)有艱難梭菌及其毒素的檢測方法主要有毒素檢測、培養(yǎng)細(xì)胞的毒素中和試 驗(yàn)、PCR等，培養(yǎng)細(xì)胞的毒素中和試驗(yàn)可能會有假陰性，使病人因治療不當(dāng)而死亡。 目前尚未見用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法檢測艱難梭菌的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種產(chǎn)毒素B艱難梭菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增快速檢測方法，以 克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，從而為食品安全提供科學(xué)的依據(jù)和指導(dǎo)作用。

本發(fā)明的主要原理為：(1)特殊設(shè)計(jì)一組可以識別靶DNA六個不同序列的兩個 內(nèi)引物(上游內(nèi)引物和下游內(nèi)引物)和兩個外引物(上游外引物和下游外引物)， 內(nèi)引物包含靶DNA的正義鏈和反義鏈；(2)其中一個內(nèi)引物首先和靶DNA雜交，隨 后的鏈置換DNA合成在具有高度鏈置換活性的DNA聚合酶的參與下由一個外引物啟 動，釋放出單鏈DNA，并作為由雜交到靶的另一端的一個內(nèi)引物和一個外引物啟動 的DNA合成模板，產(chǎn)生一個原始的莖環(huán)DNA；(3)內(nèi)引物以原始莖環(huán)DNA做模板，啟 動鏈置換DNA的合成，產(chǎn)生一個原始的莖環(huán)DNA和一個新的由兩倍莖長度的莖環(huán) DNA；(4)在等溫條件下，內(nèi)引物以莖環(huán)DNA為模板，通過鏈置換形成多個含有靶 DNA重復(fù)序列的莖環(huán)DNA，在一小時內(nèi)該循環(huán)反應(yīng)可使靶DNA累積到10⁹拷貝，可通過 熒光染料來觀察擴(kuò)增結(jié)果。

本發(fā)明涉及的產(chǎn)毒素B艱難梭菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增快速檢測方法中，包括的試劑 如下(1)-(4)：

(1)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)反應(yīng)液：

其中包括10×Thermopol反應(yīng)緩沖液、1.0—1.4mmol/L?dNTP、4—8mmol/L 硫酸鎂(MgSO4)、0.8—1.6μmol/L上游引內(nèi)物(FIP)、0.8—1.6μmol/L下游內(nèi)引 物(BIP)、0.2—0.3μmol/L上游外引物(F3)、0.2—0.3μmol/L下游外引物(B3) 和1—1.5mol/L甜菜堿；

上游內(nèi)引物：

5-AGGAGAAGCAATTGATTTTACTGGA-TACAGCTCCTCTATAATTATCTTCA-3、

下游內(nèi)引物：

5-AAGTGTATTAGCTGGGGCAAAATAT-TATTTCAACCAAAGTGGAGTGT-3、

上游外引物：5-TTCACCATCTAATTCTTTCCATTC-3、

下游外引物：5-CAATTGGAGAGACAATAATTGATG-3、

其中混合物dNTP內(nèi)的四種脫氧核糖核酸的質(zhì)量比為dUTP:dATP:dGTP:dCTP ＝2:1:1:1。