[發明專利]脫γ羧基凝血酶原微孔板化學發光免疫分析測定試劑盒及其制備方法

無效

• 申請號: 200810104145.0
• 申請日: 2008-04-16
• 公開（公告）號: CN101377505A
• 公開（公告）日: 2009-03-04
• 發明（設計）人: 張倩云;應希堂;宋勝利;胡國茂;鄭金來;于尚永
• 申請（專利權）人: 北京科美東雅生物技術有限公司
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/543;G01N21/76
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及免疫分析醫學領域，具體的，本發明提供了一種一步免疫分析方法快速、高靈敏、高特異測定脫γ羧基凝血酶原(DCP)的化學發光免疫分析試劑盒及其制備方法。

背景技術

癌癥自從誕生之日起就對人類的生存健康構成了嚴重威脅。目前腫瘤治療的關鍵在于早期發現、隨著腫瘤早期診斷進入蛋白質時代，以血液為代表的體液蛋白質成為腫瘤標志研究領域中的熱點。越來越多腫瘤標志物的發現對建立發展快速、高靈敏、高特異腫瘤標志物新型檢測技術提出了更高的要求。

肝癌是世界范圍內第五大常見癌癥，致命率居于第三位。原發性肝癌占癌癥總數的80-90％，在中國，肝癌發病率是世界其它地區的三到四倍，占世界肝癌發病總數的40％多。丙肝、乙肝、酒精肝及其它的肝臟自身免疫疾病常會引發肝硬化，從而進一步導致肝癌的產生。盡管AFP多年來一直作為HCC診斷的首選標志物，但AFP受肝炎、肝硬化的影響，并且有40％-60％的原發性肝癌人群體內AFP并不呈陽性升高，所以尋找與AFP互補的特異標志物是人們一直關注的問題。

脫γ羧基凝血酶原(DCP)又稱為維生素k缺乏或拮抗劑誘發的蛋白質PIVKA-II，可以作為HCC的特異標志物，二十多年來一直是人們研究的對象，美國食品藥物檢驗局已經將其列為HCC診斷常規檢測對象。1984年liebman，H.A首次報道DCP在HCC病人體內有明顯增加，可以作為HCC特異的肝癌標志物。DCP作為血清肝癌腫瘤標志物已經得到很多證實，并且肝臟細胞分泌DCP并不受肝硬化、慢性肝炎的影響，特異性高于AFP。與AFP、AFP-L3抗體無交叉，可以與之互補，聯合檢測HCC，降低漏檢率.在1993年Liebman系統的報道了DCP和HCC的關系，大約67％的HCCs患者體內DCP含量會顯著增加，超過300mAU/ml.另外在肝切除手術后觀察中，使用DCP腫瘤標志物做追蹤調查，與AFP相比效果更好。

檢測血清DCP受多種非特異物理吸附或者非特異結合的影響，比如凝血素、凝血酶和纖維素及其類似物等的干擾比較大，因此多克隆DCP抗體在免疫分析上受到很大影響，制約其應用。隨著分子生物學和基因工程的發展，DCP抗體應用到免疫分析檢測上，純化的DCP單克隆抗體的出現更是解決了交叉性大的問題。作為血清學標志物，DCP抗體出現后，人們試圖建立各種免疫分析方法用于DCP的檢測.目前文獻中報道的方法有:電化學發光免疫分析技術、液相親和免疫方法、免疫沉淀法、western?blot、ELISA等。

近年來在日本報道、研究的比較多，但大多用于大肝癌的臨床診斷，對于早期小肝癌的診斷由于檢測靈敏度的限制，診斷結果不是很理想。的并且在日本有市售的酶免疫分析試劑盒，方法的靈敏度自1996年以來大大改進，現在達到10mAU/ml。臨床應用方面已經有多篇報道指出DCP水平與惡性HCC具有明顯的相關性。

Wako公司也研究了DCP的檢測方法，開發了DCP定量測定試劑盒，采用液相親和色譜分離的免疫方法，該方已被美國FDA認可。檢測儀為LiBASys全自動分析儀。該方法不需要固相載體，而是采用復雜的色譜分離技術。Eisai公司研發了電化學發光免疫分析方法檢測DCP，開發了試劑盒?PIVKA-IIEISAI，用于檢測人血清中DCP含量。檢測裝置是，自全動化學發光檢測儀。原理：小鼠單克隆抗DCP抗體包被在固相微珠上，與DCP抗原、小鼠抗凝血酶原多克隆抗體(釕酸鹽化)形成夾心免疫復合物，加入電化學發光引發劑，檢測信號。全自動儀復雜，價格高，不利于在中國推廣。

發明內容：

(一)解決的技術問題

本發明迎合HCC早期診斷的需要，解決了現行的DCP檢測技術難題，即采用抗體純化技術結合高靈敏的化學發光免疫分析方法，提供了一種高靈敏、高特異、操作簡便、價格適宜的定量檢測DCP的化學發光免疫試劑盒，該試劑盒不需要特殊的分離系統，不需要昂貴的檢測儀器，便于臨床推廣，具有良好的市場價值。

本發明的目的是提供一種抗體純化技術與化學發光免疫分析方法，定量測定DCP化學發光免疫分析試劑盒，很好的解決了交叉反應大的非特異問題，解決了檢測靈敏度低而影響小肝癌早期診斷的問題。

本發明的另一目的是提供一種制備上述試劑盒的方法。

(二)技術方案

本發明所述檢測DCP化學發光免疫分析方法及試劑盒包括：DCP校準品；DCP多克隆抗體包被的微孔板；辣根過氧化物酶標記的DCP單克隆抗體；發光底物液及濃縮洗滌液。