[發明專利]重組蛛毒蛋白、其制備方法和表達載體以及用于治療ED的藥物

無效

• 申請號: 200810097404.1
• 申請日: 2008-05-23
• 公開（公告）號: CN101585872A
• 公開（公告）日: 2009-11-25
• 發明（設計）人: 胡浩;高紅
• 申請（專利權）人: 成都蓉藥集團四川長威制藥有限公司
• 主分類號: C07K14/435
• 分類號: C07K14/435;C12N15/12;C12N15/70;C12N15/81;C12N15/75;C12N15/77;C12N15/74;C12N15/85;C07K1/00;A61K38/17;A61P15/10
• 代理公司: 北京博浩百睿知識產權代理有限責任公司
• 代理人: 宋子良

技術領域

本發明涉及生化領域，具體而言，涉及一種重組蛛毒蛋白、其制備方法和表達載體以及用于治療ED(男性勃起功能障礙)的藥物。

背景技術

陰莖勃起是神經-內分泌調節下勃起器官陰莖海綿體的血流動力學變化過程。當受到性刺激后，非腎上腺素非膽堿能神經元在一氧化氮合酶(NOS)的催化下合成釋放一氧化氮(NO)；副交感神經末梢釋放的已酰膽堿激活陰莖海綿體竇及血管內皮細胞一氧化氮合酶催化下促進NO合成和釋放。NO擴散到陰莖海綿體平滑肌細胞內，激活鳥苷酸環化酶，使三磷酸鳥苷轉化為環磷酸鳥苷(cGMP)。細胞內cGMP濃度增加，使胞漿內鈣離子濃度降低，導致海綿體平滑肌松弛，陰莖海綿體竇膨脹，動脈血流增加而陰莖海綿體容積增大。隨著陰莖海綿體體積增大，圍繞陰莖海綿體的白膜被動延伸拉長，使引流海綿體血液的白膜下導靜脈受壓延伸變窄，靜脈回流阻力增加，陰莖海綿體壓力增強而誘發陰莖勃起。隨著cGMP被平滑肌細胞內磷酸二酯酶V型(PDE-5)降解，喪失其活性以及射精后交感神經恢復緊張性，陰莖轉入疲軟狀態。在這個過程中，cGMP能夠被磷酸二酯酶(PDE-5)所滅活，從而使陰莖轉入疲軟狀態。

某些種類的蜘蛛毒素對男性生殖系統的影響早已有報道，在拉美地區，被塔蘭圖拉蜘蛛咬傷的男性患者常常會經歷幾個小時的強制性陰莖勃起。在巴西、阿根廷和以色列的多個醫院，醫生已經展開多年的臨床應用，用蜘蛛毒素治療男性勃起障礙。蜘蛛毒蛋白種類非常多，研究業已證明，對此功能起主要作用的活性物質是只是漏斗網蛛毒素中的一個組分。我們用動物實驗已經證明重組蛛毒蛋白對于勃起障礙也具有活性。

在實現本發明過程中，發明人發現自然界中蜘蛛毒蛋白資源有限，且分離困難，其活性和穩定性都很難得到保證。這種動物來源的蛋白在人體使用，會引起不同程度的免疫排斥反應和潛在的病源傳播的危險。

發明內容

本發明旨在提供一種重組蛛毒蛋白、其制備方法和表達載體以及用于治療ED的藥物，以解決自然界中蜘蛛毒蛋白的問題。

在本發明的實施例中，提供了一種重組蛛毒蛋白，其由多肽鏈構成，多肽鏈包含由以下48個氨基酸構成的序列：ATCAGQDQPCKETCDCCGER?GECVCGGPCI?CRQGYFWIAW?YKLANCKK(在本發明中，命名為PnTx2-6-β)。

在上述的重組蛛毒蛋白PnTx2-6-β中，多肽鏈可以由48個氨基酸構成的序列所構成。

在上述的重組蛛毒蛋白中，多肽鏈可以進一步包含以下34個氨基酸構成的序列：MKVAILFLSI?LVLAVASESI?EESRDDFAVEELGR，該34個氨基酸構成的序列和的48個氨基酸構成的序列共同構成82個氨基酸構成的序列：MKVAILFLSI?LVLAVASESIEESRDDFAVE?ELGR?ATCAGQDQPC?KETCDCCGERGECVCGGPCI?CRQGYFWIAW?YKLANCKK(在本發明中，命名為PnTx2-6-α)。

在上述的重組蛛毒蛋白PnTx2-6-α中，多肽鏈可以由82個氨基酸構成的序列所構成。

在本發明的實施例中，還提供了一種重組蛛毒蛋白的制備方法，使用大腸桿菌進行表達制備上述的重組蛛毒蛋白PnTx2-6-β，其包括以下步驟：

步驟i.人工合成以下DNA片段，

1???gccacatgcg?ctggccaaga?ccagccctgc?aaagaaactt?gcgactgctg?tggagagaga

61??ggagaatgtg?tttgcggagg?accttgcatt?tgcaggcaag?gctacttttg?gatagcatgg

121?tataaacttg?ctaactgtaa?aaaatga

步驟ii.以該DNA片段為模版，擴增出包含

gc?cacatgcgct?ggccaagacc?agccctgcaa?agaaacttgc?gactgctgtg?gagagagagg

agaatgtgtt?tgcggaggac?cttgcatttg?caggcaaggc?tacttttgga?tagcatggta

taaacttgct?aactgtaaaa?aatga

的核苷酸序列，回收核苷酸序列，在多克隆位點將其插入原核表達載體中得到重組表達載體；

步驟iii.用氯化鈣法制備DH5α感受態細胞后，用前述重組表達載體轉化DH5α感受態細胞，在抗性平板中挑取單菌落，經過培養后抽提得到質粒；