[發(fā)明專利]重組蛛毒蛋白、其制備方法和表達載體以及用于治療ED的藥物

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200810097404.1
• 申請日: 2008-05-23
• 公開（公告）號: CN101585872A
• 公開（公告）日: 2009-11-25
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 胡浩;高紅
• 申請（專利權(quán)）人: 成都蓉藥集團四川長威制藥有限公司
• 主分類號: C07K14/435
• 分類號: C07K14/435;C12N15/12;C12N15/70;C12N15/81;C12N15/75;C12N15/77;C12N15/74;C12N15/85;C07K1/00;A61K38/17;A61P15/10
• 代理公司: 北京博浩百睿知識產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司
• 代理人: 宋子良

1.一種重組蛛毒蛋白，其特征在于，其由多肽鏈構(gòu)成，所述多肽鏈包含由以下48個氨基酸構(gòu)成的序列：ATCAGQDQPCKETCDCCGER?GECVCGGPCI?CRQGYFWIAWYKLANCKK。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組蛛毒蛋白，其特征在于，所述多肽鏈由所述48個氨基酸構(gòu)成的序列所構(gòu)成。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組蛛毒蛋白，其特征在于，所述多肽鏈進一步包含以下34個氨基酸構(gòu)成的序列：MKVAILFLSILVLAVASESI?EESRDDFAVE?ELGR，該34個氨基酸構(gòu)成的序列和所述的48個氨基酸構(gòu)成的序列共同構(gòu)成82個氨基酸構(gòu)成的序列：MKVAILFLSI?LVLAVASESI?EESRDDFAVE?ELGRATCAGQDQPC?KETCDCCGER?GECVCGGPCICRQGYFWIAW?YKLANCKK。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組蛛毒蛋白，其特征在于，所述多肽鏈由所述82個氨基酸構(gòu)成的序列所構(gòu)成。

5.一種重組蛛毒蛋白的制備方法，其特征在于，使用大腸桿菌進行表達制備權(quán)利要求1或2所述的重組蛛毒蛋白，其包括以下步驟：

步驟i.人工合成以下DNA片段，

1???gccacatgcg?ctggccaaga?ccagccctgc?aaagaaactt?gcgactgctg?tggagagaga

61??ggagaatgtg?tttgcggagg?accttgcatt?tgcaggcaag?gctacttttg?gatagcatgg

121?tataaacttg?ctaactgtaa?aaaatga

步驟ii.以該DNA片段為模版，擴增出包含

gc?cacatgcgct?ggccaagacc?agccctgcaa?agaaacttgc?gactgctgtg?gagagagagg

agaatgtgtt?tgcggaggac?cttgcatttg?caggcaaggc?tacttttgga?tagcatggta

taaacttgct?aactgtaaaa?aatga

的核苷酸序列，回收所述核苷酸序列，在多克隆位點將其插入原核表達載體中；

步驟iii.用氯化鈣法制備DH5α感受態(tài)細胞后，用所述構(gòu)建好的表達載體轉(zhuǎn)化所述DH5α感受態(tài)細胞，在抗性平板中挑取單菌落，經(jīng)過培養(yǎng)后抽提得到的質(zhì)粒；

步驟iv.將所述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入感受態(tài)Rosetta?2大腸桿菌，從轉(zhuǎn)化后含有正確表達所述質(zhì)粒的抗性平板中挑取單菌落，接種于含葡萄糖和抗生素的LB或TB培養(yǎng)基中，在20-37℃的條件下以100-300rpm的轉(zhuǎn)速在氣浴或水浴中培養(yǎng)至OD600＝1.2，加入IPTG至終濃度為1mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)4小時，然后以4℃2000g離心10分鐘，收集得到的菌體；

步驟v.將所述菌體與100mMNaCl，50mMTris?pH8.0混合，采用細胞破碎技術(shù)將細胞進行破碎，以12000rpm離心，收集上清，然后經(jīng)親和層析柱、離子交換柱和凝膠排阻色譜進行層析純化，并經(jīng)過無菌過濾后，在-30℃至7℃凍干，得到權(quán)利要求1或2所述的重組蛛毒蛋白。