[發明專利]一種多功能病毒載體的構建和應用

在審

• 申請號: 202011032401.7
• 申請日: 2020-09-27
• 公開（公告）號: CN112481304A
• 公開（公告）日: 2021-03-12
• 發明（設計）人: 于峰;黃明輝
• 申請（專利權）人: 鎮江維根生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;A61K39/00;A61P35/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明涉及生物技術領域，具體提供了一種多功能病毒載體的構建方法及其應用，所述病毒載體可同時具備多種功能：shRNA干擾、外源基因誘導型表達和外源基因組成型表達。本發明采用基因工程方法將U6（或H1）啟動子、NFAT誘導表達啟動子和EF1a/5^’?LTR雜合啟動子調控的功能區整合到一個重組載體中，顯著提高了病毒載體使用范圍，有助于提高腫瘤細胞對CART細胞敏感性，為新型溶瘤病毒藥物和免疫治療提供了全新方向，有利于推動細胞治療藥物的研究。

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域和腫瘤免疫治療領域，涉及一種多功能病毒載體的制備方法及其應用。

背景技術

背景技術

目前對于腫瘤的治療不少的新型治療手段已經在臨床上應用，這對于提升生存期并改善生活質量極為有效，但是由于腫瘤耐藥性的原因，使得大部分抗癌藥物在后期失去了治療效果，進而導致腫瘤的復發和反復。基因治療在未來將是腫瘤患者一個可能的選擇，有可能解決化療藥物失活、多藥耐藥性的產生等現象，目前選擇的靶點有細胞死亡/凋亡的基因、藥物代謝途徑靶點基因、表觀遺傳相關基因等。所以，針對新的基因靶點設計基因治療藥物進而進行有效的腫瘤治療具有重要意義。

利用基因工程修飾的T細胞(如CAR-T、TCR-T)進行過繼性免疫治療已取得突破性進展，例如利用CD19 CAR-T進行白血病治療，90%的急性淋巴細胞白血病患者得到完全緩解。然而，基于免疫細胞的腫瘤靶向治療在實體腫瘤的治療中效果非常有限，主要原因在于：（1）免疫檢查點，例如PD-1.TIM-3，LAG-3，CTLA-4等限制了CAR-T細胞在腫瘤局部的存活時間；（2）此外，腫瘤局部缺少刺激免疫細胞增殖的細胞因子，例如IL-2，IL-12，IL-15等削弱了CAR-T細胞在腫瘤局部的抑瘤作用；（3）腫瘤組織的異質性導致傳統針對單一靶點的CAR-T細胞很難完全清除所有的腫瘤細胞。

慢病毒載體在基因治療應用中取得了很大的進展，大規模生產臨床級病毒載體來轉移遺傳物質已經可以實現。慢病毒載體可以廣泛地轉導多種細胞類型，并整合到分裂細胞和非分裂細胞的宿主基因組中，從而使轉基因在體內外長期表達。

針對目前的臨床需求和問題，研究者已經嘗試多種解決方案，例如，用攜帶IL-12的CAR-T治療腫瘤；用CAR-T細胞聯合雙特性抗體克服腫瘤異質性導致的腫瘤免疫逃逸；用shRNA敲降CAR-T細胞的免疫檢查點基因PD-1 或TIM-3等以阻斷免疫檢查點引發的CAR-T細胞耗竭等。但是這些方法都是在某一個層面，部分解決CAR-T細胞治療實體腫瘤遇到的困境,提示多種手段聯用將大有前景。但由于免疫細胞天然具有抵抗外源基因轉導的特性，從而在同一細胞上多次轉導幾種不同功能的病毒載體難以實現，造成難以將多種手段聯合起來解決問題。

因此，在本發明中我們提出了一種轉染人類細胞的慢病毒載體用于轉染CAR-T細胞，構建一種同時具有基因干擾、調控性表達和CAR組成型表達的多功能病毒載體，包括應用基因治療的技術調節靶點基因表達，能夠明顯降低惡性腫瘤細胞入侵及擴散，有效提高CART細胞在腫瘤細胞中發揮作用，以實現多手段聯合治療腫瘤。

發明內容

針對現有技術的不足，本發明提供一種多功能病毒載體的制備方法，用于減少細胞轉導的次數,實現一次轉導,達到三次轉導的功能,并大大提高效率。用此載體可以制備多功能的CAR-T細胞，并提高CAR-T細胞制備效率，以提高腫瘤治療效果。

為實現該目的，本發明采用以下技術方案：

第一方面，本發明提供了一種多功能組合啟動子，可以用于構建多種病毒載體，所述多功能組合啟動子包括由三個啟動子U6或H1啟動子、NFAT啟動子和EF1a/5^’-LTR啟動子構成的組合啟動子框架，所述組合啟動子還包括三組多克隆位點（MCS）。

本發明中，三個啟動子可以在框架內隨意組合，拓展了載體的功能。