[發明專利]抗牛成熟朊蛋白的單克隆抗體mab－mPrP－N59及其應用

無效

• 申請號: 200810090550.1
• 申請日: 2008-03-28
• 公開（公告）號: CN101260155A
• 公開（公告）日: 2008-09-10
• 發明（設計）人: 劉永生;張杰;陳豪泰;孫德惠;馬麗娜
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院蘭州獸醫研究所
• 主分類號: C07K16/18
• 分類號: C07K16/18;C12N15/12;C12N15/70;C12N5/18;C07K14/47;G01N33/577
• 代理公司: 蘭州振華專利代理有限責任公司
• 代理人: 張晉

技術領域

本發明涉及采用基因工程制備一種單克隆抗體(以下簡稱為單抗)及其制備方法和用途。

背景技術

“唯蛋白”理論認為瘋牛病、癢病、人變異性克雅氏病等傳染性海綿狀腦病是由一種不含有核酸的蛋白質----朊病毒(Scrapie?Prion?Protein，PrPSc，癢病型朊蛋白)引起的。PrPSc是由牛、羊、人等宿主體內一種正常存在的朊蛋白(CellularPrion?Protein，PrPC，細胞型朊蛋白)構像轉變后生成的。PrPSc與PrPc在自然界是不可分割存在的，PrPc堪稱是PrPSc形成的原料，存在的載體。PrPc廣泛存在于哺乳動物體內，主要分布在腦組織、脊髓、淋巴組織中。大量的研究證實了瘋牛病的主要傳播途徑是通過食用被PrPSc污染的肉骨粉飼料蛋白引起的。肉骨粉是以牛、羊等動物的下腳料為原料，加工成的一種動物蛋白飼料。由于肉骨粉價格低廉，蛋白含量高，所以，在上個世紀的80年代和90年代被一些西方國家廣泛采納，這導致了瘋牛病的大暴發。最初，通過食用被癢病因子污染的肉骨粉，使得英國等一些歐洲國家的牛感染上了瘋牛病，人通過食用用病牛加工的食品而感染上變異性克雅氏病。而今，肉骨粉在許多國家被禁止用于動物飼料。控制動物飼料，禁止PrPC風險成分進入動物和人的食物鏈是防止瘋牛病侵入和傳播，保證人身安全的關鍵措施。我國頒布了有關公告和禁令，但是能否很好地執行這些規定在很大程度上取決于檢測進口飼料和食品中PrPC的存在。檢測飼料和食品中PrPC存在的方法除了DNA雜交、PCR擴增等DNA方法外，還有蛋白質分析和組織鑒定兩大類方法。在這兩大類分析方法中，以酶聯免疫吸附分析(Enzyme?Linked?Immunosorbant?Assay，ELISA)、免疫印跡(Western?Blotting)和生物傳感器技術為主要內容的免疫學方法是其主體技術。檢測飼料和食品中PrPC存在的各種免疫學方法的關鍵試劑就是針對PrPC的多抗和單抗，由于PrPC蛋白在哺乳動物中非常保守，氨基酸變化小，所以，以單抗作為診斷試劑比多抗更優越。

PrPC是一種糖基磷脂酰肌醇(GPI)錨定的膜蛋白，由氨基端的信號肽、中間的成熟蛋白和羧基端的GPI錨結合區三部分組成。PrPC經過翻譯后修飾，最終是以被GPI錨定的成熟蛋白形式展現在細胞表面。所以，制備出針對成熟PrPC(mature?prion?protein，mPrP)的單抗，在此基礎上開發出免疫印跡、雙抗體夾心ELISA、免疫實時PCR等各種免疫診斷試劑盒，可以用于檢測食品和飼料中是否存在PrPC。此外，這些單抗還可以作為研究PrPC蛋白結構與功能的有力工具。各種單抗的制備目前仍然以淋巴細胞雜交瘤技術為主，因為該技術成熟、穩定、制作成本較為低廉。而今，用于動物免疫的免疫原越來越趨向于以重組蛋白取代天然蛋白，這樣易化了材料來源。

發明內容

本發明的目的之一是提供一種抗牛mPrP的單抗，同時給出該單抗的輕鏈和重鏈可變區編碼基因；本發明的目的之二是提供這種單抗的一種制備方法；本發明的目的之三是提供該單抗的用途。

本發明所涉及的抗牛成熟朊蛋白mPrP的單抗被命名為：“mab-mPrP-N59”，其輕鏈可變區基因見后附的序列表<400>2，其重鏈可變區基因見后附的序列表<400>3。

Mab-mPrP-N59的制備方法如下：是以牛mPrP編碼基因為目的產物選擇模板與引物，用聚合酶鏈式反應(PCR)擴增出牛mPrP編碼基因，用EcoRI和XhoI雙酶切擴增產物和原核表達載體，回收酶切產物，在連接酶的作用下將酶切后的mPrP編碼基因和原核表達載體連接，將連接產物轉入E.Coli?JM109感受態細胞中進行培養，然后將培養菌液涂布于含相應抗生素的培養基上培養，挑取單菌落經鑒定后擴大培養，提取含有牛mPrP編碼基因的重組表達質粒，將此重組表達質粒轉入E.Coli?JM109(DE3)中，經鑒定正確后，進行誘導表達，純化、復性表達產物，以經純化復性的表達產物為免疫原免疫小鼠，取免疫鼠的脾細胞與鼠骨髓瘤細胞融合，篩選出雜交瘤細胞株，并克隆出陽性雜交瘤細胞株，在鼠體內接種雜交瘤細胞生產腹水抗體，取出腹水進行純化得到抗牛成熟朊蛋白的單抗。