[發(fā)明專利]一種可產(chǎn)生包裝大片段RNA病毒樣顆粒的雙質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200810089697.9
• 申請(qǐng)日: 2008-04-14
• 公開（公告）號(hào): CN101503700A
• 公開（公告）日: 2009-08-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李金明;楊昌梅;魏玉香;王露楠;魏葆珺;鄧巍;張瑞
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 衛(wèi)生部北京醫(yī)院
• 主分類號(hào): C12N15/70
• 分類號(hào): C12N15/70;C12N15/62;C12N15/50;C12N15/51;C12N15/44;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 北京北新智誠(chéng)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司
• 代理人: 李 超

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種可產(chǎn)生包裝大片段RNA病毒樣顆粒的雙質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

RNA病毒如丙型肝炎病毒(Hepatitis?C?virus，HCV)、人免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiency?virus，HIV)、嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒(Severe?acuterespiratory?syndrome?coronavirus，SARS-CoV)、高致病禽流感病毒H5N1等是一類可致人類嚴(yán)重疾病的病原體。病毒RNA檢測(cè)對(duì)于感染的早期診斷，以及抗病毒治療療效的動(dòng)態(tài)觀察，是一個(gè)必不可少的手段。從二十世紀(jì)九十年代初開始，人們逐漸采用分子診斷方法(Molecular?diagnostic?assay)來檢測(cè)病毒RNA，此類技術(shù)靈敏特異使之成為許多病毒RNA的主要檢測(cè)方式，甚至唯一的檢測(cè)方式。目前最常用的檢測(cè)方法包括實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real?time?reaverse?transcription?PCR，RT-PCR)、核酸序列依賴性擴(kuò)增NASBA、branched?chain?DNA?RT—PCR檢測(cè)法和連接酶酶促鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增(TMA)。

使用分子診斷方法檢測(cè)RNA病毒要得到可靠的結(jié)果，必須要有嚴(yán)格的質(zhì)量控制措施，很關(guān)鍵的一點(diǎn)就是要有特定RNA病毒的質(zhì)控品。同時(shí)，要對(duì)病毒進(jìn)行定量測(cè)定，通常還須有RNA病毒標(biāo)準(zhǔn)品。目前RNA病毒擴(kuò)增檢測(cè)的質(zhì)控品和標(biāo)準(zhǔn)品包括裸RNA片段、病毒顆粒以及帶盔甲的RNA(armored?RNA)。裸露的RNA易于受到廣泛存在的核糖核酸酶(RNA?nuclease，ribonuclease，RNase)的降解，而且，用裸露的RNA作為標(biāo)準(zhǔn)品的另一個(gè)缺陷是其不能夠?qū)z測(cè)的全過程進(jìn)行監(jiān)測(cè)，因?yàn)闃颖局幸话阌蠷Nase的存在，直接將其加入樣本會(huì)被降解，即使將其加入裂解液中，也會(huì)使標(biāo)準(zhǔn)品受到樣本中的RNase降解。用病毒顆粒作為標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)，由于病毒顆粒有傳染性，而且，其制備運(yùn)輸困難，所以，盡管目前有人應(yīng)用牛腹瀉病毒(BVDV)作為檢測(cè)HCV的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)品，或者用HCV病毒顆粒作為檢測(cè)HCV?RNA的標(biāo)準(zhǔn)品代替WHO提供的HCV標(biāo)準(zhǔn)品，或者用HIV病毒顆粒作為通用的病毒RNA標(biāo)準(zhǔn)品。但是，這些技術(shù)無法克服病毒顆粒傳染性、病毒顆粒制備運(yùn)輸困難等問題，也就是說病毒顆粒不是理想的標(biāo)準(zhǔn)品。鑒于上述二種標(biāo)準(zhǔn)品的缺陷，需要設(shè)計(jì)一種制備簡(jiǎn)單、定量容易、耐RNase的RNA檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品。DuBois等發(fā)明的armored?RNA技術(shù)可以滿足上述要求，制備耐RNase、無生物傳染性的RNA。armored?RNA是MS2噬菌體樣病毒樣顆粒，是MS2噬菌體的包膜蛋白與RNA的復(fù)合物。DuBois等用單質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)病毒樣顆粒，在構(gòu)建質(zhì)粒時(shí)，利用分子克隆技術(shù)依次將MS2的成熟酶蛋白、包膜蛋白、包裝位點(diǎn)以及病毒標(biāo)準(zhǔn)品序列克隆到表達(dá)載體的下游，經(jīng)過誘導(dǎo)表達(dá)，包膜蛋白組裝成病毒樣顆粒并將目的RNA包裝于包膜蛋白內(nèi)。armored?RNA制備運(yùn)輸方便、定量容易，并且可以以內(nèi)部參照物的形式監(jiān)測(cè)檢測(cè)的全過程。現(xiàn)如今，armored?RNA已廣泛用于RT-PCR和branched?chain?DNA檢測(cè)的質(zhì)控品。但這種方法包裝的RNA片段的長(zhǎng)度只有500bp左右，當(dāng)RNA片段長(zhǎng)度超過500bp時(shí)，包裝效率顯著降低。在檢測(cè)RNA病毒時(shí)，盡管大多數(shù)RT-PCR試劑盒擴(kuò)增的片段不超過500bp，但如果上述耐RNase的病毒樣顆粒能包裝長(zhǎng)片段的RNA，則其在RNA病毒的臨床檢測(cè)的質(zhì)量控制和標(biāo)準(zhǔn)化上具有更為廣泛的應(yīng)用價(jià)值。例如，采用bDNA技術(shù)檢測(cè)HIV，所使用的HIV?RNA標(biāo)準(zhǔn)品要長(zhǎng)至3kb左右。此時(shí)，用前述的方法不可能得到一個(gè)內(nèi)含如此長(zhǎng)的外源RNA的可用作質(zhì)控品和標(biāo)準(zhǔn)品的病毒樣顆粒；此外，就某個(gè)特定的病毒的檢測(cè)而言，不同試劑廠家生產(chǎn)的RT-PCR試劑盒的擴(kuò)增靶片段可能是不同的，如果把不同廠家的目的片段構(gòu)建到一條RNA鏈上，并且包裝入包膜蛋白內(nèi)，形成病毒樣顆粒，那么不同的實(shí)驗(yàn)室之間就可以對(duì)結(jié)果進(jìn)行直接的比較；還有如果把不同病毒要擴(kuò)增的目的片段構(gòu)建在一起，形成嵌合體，并包裝入病毒樣顆粒內(nèi)，這種病毒樣顆粒就可以作為對(duì)同一個(gè)標(biāo)本進(jìn)行多個(gè)病毒的同時(shí)檢測(cè)時(shí)可應(yīng)用的多靶核酸標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品，既節(jié)省了成本，也減化了操作程序。