[發明專利]用于外加直流電場下觀察細胞生物學行為的裝置

無效

• 申請號: 200810070287.X
• 申請日: 2008-09-11
• 公開（公告）號: CN101353624A
• 公開（公告）日: 2009-01-28
• 發明（設計）人: 李飛;李梅;馮華;盧佳友;吳國材
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第三軍醫大學
• 主分類號: C12M3/00
• 分類號: C12M3/00;C12M1/42
• 代理公司: 北京同恒源知識產權代理有限公司
• 代理人: 趙榮之

技術領域

本發明涉及細胞生物學領域，特別涉及一種用于外加直流電場下觀察細 胞生物學行為的裝置。

背景技術

直流電場(direct-current?electric?fields，dcEF)在生物體中廣泛存 在，是由于多種帶電離子(如Na⁺、K⁺、Ca²⁺、HCO₃^-、Cl^-等)在細胞內外、細 胞與細胞之間、組織和器官不同部位分布的差異而產生的。近年來，人們對 直流電場的生物效應的研究逐漸深入，涉及胚胎發育中組織形成、炎癥反應 以及損傷修復等細胞生物學各個領域，已經證實多種細胞的運動、分裂，如 胚胎發育中神經細胞的遷移、腫瘤細胞的侵襲與轉移等，受到直流電場的影 響；應用外加直流電場刺激，可引導軸突再生治療難治性脊髓損傷修復，或 調節皮膚傷口愈合等。直流電場的生物效應研究正日益受到人們的重視，其 研究意義重大，目前尚處于起步階段，主要是在細胞水平上對直流電場下細 胞的生物學行為進行研究。此項研究需要一種制作簡便、性能穩定、重復性 好、可用于實時動態觀察的裝置，能夠產生穩定的生理強度的電場，長時間 作用于培養的細胞，并能在顯微鏡下觀察細胞活動情況。

此種裝置目前較成熟的是文獻報道的Min?Zhao等制作的裝置(Nature Protocols，2(6)：1479-1489，2007；Nature，442：457-460，2006)，即 先制作一個方形的玻璃井；再在細胞培養皿底部并排粘上兩塊蓋玻片，兩塊 蓋玻片之間留出一定距離形成通道，用3140硅膠在培養皿底部沿兩塊蓋玻片 的上緣和下緣(通道部分截斷)分別筑二道隔離堤，使電流僅從通道通過； 然后將玻璃井置于通道中，井內加入細胞懸液，待細胞在通道底部貼壁生長 后移除玻璃井，在通道頂部、于兩塊蓋玻片之間粘上蓋玻片，形成電流通過 空間；再在培養皿中加入培養基；最后蓋上培養皿蓋，接上瓊脂膠鹽橋、銀- 氯化銀電極及電源，置顯微鏡下進行觀察。但該裝置存在以下缺陷：(1)制 作復雜、耗時且不能重復使用；(2)每次制作的裝置之間可能存在誤差而影 響實驗結果的精確性；(3)每次制作時需粘貼蓋玻片和涂膠，易破壞細胞培 養部位的無菌狀態，且硅膠在完全干燥前可能釋放某些化學物質至培養基中 而導致培養基的污染；(4)通道頂部粘貼的蓋玻片的高度難以阻擋培養基漫 過，當加入培養基過多或移動培養皿時培養基易漫過蓋玻片而影響觀察；(5) 對觀察的細胞難以定位，無法將某細胞的生物學行為觀察結果與后續的分子 生物學或細胞生物學檢測結果相對照；(6)難以實現同等條件下兩種細胞的 直觀比較；現有技術中，比較兩種細胞多采用分別觀察，再將數據進行統計 學處理的方法，其缺點在于無法保證每次實驗條件完全一致；也可采用對其 中一種細胞進行熒光標記，然后在同一細胞爬片上同時觀察兩種細胞的方法， 其缺點在于需將能夠表達熒光蛋白的載體轉染入細胞，成本昂貴，操作復雜， 對轉染效率要求高，在不能100％表達熒光蛋白的情況下，很難對兩種細胞各 自的生物行為學進行準確的判斷；還可采用在同一爬片上筑隔離堤，在隔離 堤兩邊分別培養兩種細胞的方法，其缺點在于培養細胞時兩種細胞極易混合， 且隔離堤往往不能做得足夠薄，難以達到在同一顯微鏡視野下觀察兩種細胞 的目的；(7)不能實時監測或控制通過細胞的直流電場的強度，并通過監測 隨時對電源輸出的電壓進行調整；(8)不能序貫性觀察不同電場方向對細胞 的影響。

唐波等在Min?Zhao等的基礎上制作了一種改進裝置(第三軍醫大學學報， 27(7)：683-684，2005)，包括直流電源、電極系統、觀測小室和細胞培養 室。其改進點主要在于：先在蓋玻片上培養細胞，再將制好的細胞爬片放入 載玻片上的“U”型槽中，在“U”型槽頂部粘貼載玻片，形成觀測小室；然 后將觀測小室粘貼至一個由有機玻璃制成的方形小室的底板正中，制成細胞 培養室；細胞培養室頂蓋上位于觀測小室上方設置兩孔，用于實驗中測量電 壓。這些改進僅克服了Min?Zhao等制作裝置的部分不足，仍然存在制作較復 雜，制作過程易導致污染，培養基易漫過蓋玻片，對觀察的細胞難以定位， 難以實現同等條件下兩種細胞的直觀比較，不能序貫性觀察不同電場方向對 細胞的影響等缺陷，且有機玻璃制成的細胞培養室不能應用常規的高壓消毒。

發明內容