[發(fā)明專利]重組靶向抗凝血酶活性和抗血小板聚集的融合蛋白及制備方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200810069786.7
• 申請(qǐng)日: 2008-05-30
• 公開（公告）號(hào): CN101284877A
• 公開（公告）日: 2008-10-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 胡宗利;張寧;陳國(guó)平;李勇;顧峰;候曉姝
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 重慶大學(xué)
• 主分類號(hào): C07K19/00
• 分類號(hào): C07K19/00;C12N15/62;C12N15/63;C12N15/81;A61K38/16;A61P7/02
• 代理公司: 重慶志合專利事務(wù)所
• 代理人: 胡榮琿

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物工程制藥領(lǐng)域，具體涉及一種靶向性抗凝血酶活性和抗血小板聚集的融合蛋白及制備方法。

背景技術(shù)

心腦血管系統(tǒng)疾病是一類危害人類健康的重要疾病，每年約有1700萬人死于該疾病，因此多年來人們一直致力于研制有效的治療血栓的藥物。水蛭素是存在于醫(yī)用水蛭唾液腺中的單鏈多肽，由65個(gè)氨基酸殘基組成，分子量為7KD，是最有效的天然凝血酶抑制劑，可作為抗栓藥物用于治療血栓性疾病。與肝素、阿司匹林等傳統(tǒng)的抗凝藥物相比，水蛭素用量小，療效高，無毒性，有又無明顯抗原性。同時(shí)水蛭素也存在一些問題，極大地影響了水蛭素的臨床應(yīng)用：①過量的水蛭素會(huì)容易引起非溶栓部位出血，發(fā)生明顯的全身出血現(xiàn)象，并且水蛭素所致的全身出血沒有良好的對(duì)抗藥物；②水蛭素只有特異的抗凝血酶活性，功能單一，不能從多個(gè)途徑阻斷血栓的形成，儀能有效地防治靜脈血栓，而不能防治動(dòng)脈血栓。③傳統(tǒng)方法從醫(yī)用水蛭中提取獲得天然水蛭素，產(chǎn)量很低，價(jià)格非常昂貴。

凝血因子FXa在凝血途徑中處于關(guān)鍵和核心位置。FXa在游離狀態(tài)下活性很低，但在血栓部位活性將顯著提高，可特異地識(shí)別FXa識(shí)別序列Ile-Glu-Gly-Arg并將其全部切下。如果在水蛭素N端融合FXa識(shí)別序列，在非血栓部位，水蛭素N端被封閉而喪失其抗凝活性；在血栓部位，活化的FXa會(huì)將FXa識(shí)別序列特異地全部切下，釋放出水蛭素抗凝活性，使水蛭素靶向性地在血栓部位體現(xiàn)出抗凝的功能而減少出血副作用。

糖蛋白(GP)II?b2?IIIa是血小板膜上含量最豐富的一種蛋白質(zhì)，其與血纖維蛋白原的結(jié)合被認(rèn)為是血小板聚集的最終共同途徑。在血小板被活化后，GP?II?b2IIIa能通過識(shí)別配體上的RGD序列(Arg-Gly-Asp)與血纖維蛋白原相結(jié)合。因此利用RGD肽競(jìng)爭(zhēng)性的阻斷它們的相互作用，從而抑制血小板的聚集就成為治療血栓性疾病的一種有效手段。將RGD三肽序列引入水蛭素32～35位突變位點(diǎn)，能在保留水蛭素抗凝活性的同時(shí)，也增加了抗血小板聚集的活性(Zhang?YG，Yue?L，Song?HY.Design?of?a?Novel?Plasminogen?Activator?Based?on?the?Structure?ofHirudin.Acta?Biochimica?et?Biophysica?Sinica，2006，38：531-536.)因此，將抗凝血酶藥物和抗血小板聚集藥物組合形成融合抗栓劑已成為抗血栓藥物發(fā)展的新方向。

巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)作為一種高效的表達(dá)系統(tǒng)，和其它原核、真核表達(dá)系統(tǒng)相比，具有許多優(yōu)點(diǎn)：具有強(qiáng)有力的醇氧化酶基因(AOX)啟動(dòng)子，可嚴(yán)格調(diào)控外源蛋白的表達(dá)，外源蛋白表達(dá)量高；畢赤酵母無內(nèi)源型載體，外源目的基因需整合到宿主染色體上實(shí)現(xiàn)整合型表達(dá)，穩(wěn)定性高；畢赤酵母可分泌表達(dá)外源蛋白，自身分泌的蛋白非常少，因此非常有利于目的蛋白的純化；畢赤酵母具有真核生物的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，具有糖基化、脂肪?；?、蛋白磷酸化等翻譯后修飾加工功能；發(fā)酵工藝成熟，易放大，培養(yǎng)基不含蛋白，較廉價(jià)，便于工業(yè)化生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的，是提供一種重組靶向抗凝血酶活性和抗血小板聚集的融合蛋白(FXa-RGD-HV)。它由抗凝血酶活性和抗血小板聚集的RGD-HV及其N端的FXa識(shí)別序列組成。

本發(fā)明的重組靶向抗凝血酶活性和抗血小板聚集的融合蛋白包括兩個(gè)主體部分，一個(gè)是在融合蛋白N端的FXa識(shí)別序列(Ile-Glu-Gly-Arg)，增加融合蛋白的靶向性而降低出血的副作用；另一個(gè)是含有64個(gè)氨基酸殘基的抗凝血酶活性和抗血小板聚集的雙功能水蛭素變異體(命名為RGD-HV)(序列表SEQ?ID?NO：1)，其氨基酸序列是在天然水蛭素的32～35位突變位點(diǎn)引入RGD三肽序列所組成的，從而在抗凝血酶活性的基礎(chǔ)上增加抗血小板聚集作用。

為了便于融合蛋白的分離純化，本發(fā)明在融合蛋白N端引入9×His-tag用于蛋白親和層析，并在9×His-tag和融合蛋白之間加入腸激酶(EK)酶切位點(diǎn)(Asp-Asp-Asp-Asp-Lys)，以便于去除親和層析純化后融合蛋白的9×His-tag。

本發(fā)明所述的融合蛋白的氨基酸序列從N端依次為9×His-tag、EK酶切位點(diǎn)、FXa識(shí)別序列和RGD-HV(序列表SEQ?ID?NO：2)。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供編碼本發(fā)明融合蛋白的DNA序列(序列表SEQ?IDNO：3)和攜帶該DNA序列的重組表達(dá)載體。