[發明專利]一種雞A－FABP抗血清制備及其在特異性鑒定中的應用方法

無效

• 申請號: 200810063846.4
• 申請日: 2008-01-11
• 公開（公告）號: CN101241129A
• 公開（公告）日: 2008-08-13
• 發明（設計）人: 李輝;石慧;王啟貴
• 申請（專利權）人: 東北農業大學
• 主分類號: G01N33/531
• 分類號: G01N33/531;G01N33/53
• 代理公司: 哈爾濱市哈科專利事務所有限責任公司
• 代理人: 劉婭

(一)技術領域

本發明屬于分子生物學領域，特別是涉及一種抗血清制備和特異性鑒定的方法。

(二)背景技術

近年來，脂肪細胞型脂肪酸結合蛋白(A-FABP)作為影響肌內脂肪(Intamuscular?fat，IMF)的重要候選基因之一，越來越受到人們的關注(Calnek?B?W?et?al，1999；許寧迎等，2004)。目前，針對小鼠A-FABP基因的研究主要是構建敲除小鼠模型，通過研究野生型小鼠與A-FABP敲除型小鼠在脂肪酸的攝取情況、脂類分解代謝、脂類合成代謝、營養性肥胖誘導的胰島素抗性以及脂肪細胞大小等方面的差異來揭示該基因的生物學功能(Hertzel?et?al，2005；Hertzel?et?al，2002；Coe?et?al，1999；Shen?et?al，2001)。針對豬A-FABP基因的研究主要是將其作為一個影響豬肌內脂肪代謝的候選基因，研究該基因的多態性與肌內脂肪(MF)含量的相關性(李楨等，2004；Gerbens等，1998；Brockmann等，1996)。對于雞A-FABP基因的研究與豬上的研究相似，主要是研究該基因的多態性與肌內脂肪沉積等脂肪性狀的相關性(葉滿紅等，2003；Wang等，2006；李文娟等，2006；羅桂芬等，2006)。

隨著蛋白組學時代的到來，研究某一基因的生物學功能需要從轉錄水平延伸到蛋白水平，獲取目的蛋白的抗血清是在蛋白質水平上研究基因功能的不可缺少的部分。常規的多克隆抗血清的制備方法包括抗血清的制備和抗血清特異性驗證兩部分。抗血清制備主要是獲得質量好的抗原，通過靜脈內、腹腔內、肌肉內、皮內、皮下或淋巴結內注射等方式免疫動物，最后收集和分離抗血清。抗血清特異性檢測方法可歸納為以下三種。(1)Western?blot分析抗血清與IPTG誘導的空載體轉化的細菌裂解物以及相應原核表達的蛋白發生免疫反應的能力(羊鍵等，2007)；(2)Western?blot分析抗血清與確定不含有目的抗原的樣品的免疫反應情況(高瑞等，2007；蘭玉菲等，2007；趙振東等，2007；王乃東等，2006)；(3)用凝血酶將融合蛋白的標簽(GST)切下，然后進行western?blot分析抗血清分別與標簽和目的蛋白發生免疫反應的情況(張寶紅等，2005)。這些方法均存在不同程度的局限性，不能徹底的證明所制備的抗血清是否為目標基因編碼產物所產生的抗血清。

水動力轉染法(Hydodynamics?transfection，HD)是1999年出現的一種新的基因體內轉染方法，它通過在高壓下向小鼠尾靜脈快速注射大體積含目的基因的生理鹽水從而實現目的基因在小鼠體內的高效表達。該方法的主要機理是高壓作用引起內皮細胞和細胞膜破裂，從而使質粒進入細胞內部得到高效表達(Liu等，1999)。水動力轉染法技術具有快速、簡單、方便、穩定、高效、安全等多方面的優點(Zhang等，2004；胡錦輝等，2003)。自1999年建立該方法以來引起了很多研究者極大的興趣，水動力轉染可以被用來進行DNA、RNA、蛋白質和其它的一些不能通過膜滲透的物質轉染(Liu等，2001)。

(三)發明內容

本發明的目的是提供一種分子生物學技術，即利用雞A-FABP原核表達蛋白免疫家兔制備雞A-FABP抗血清，同時利用水動力轉染法使雞A-FABP在小鼠肝臟中表達，并檢測所制備的抗血清特異性，進而應用該抗血清檢測A-FABP在雞不同組織中的表達情況，最終提出一種雞A-FABP抗血清制備及特異性鑒定的方法。

本發明的雞A-FABP抗血清制備方法是這樣實現的：

1、原核和真核表達質粒的構建：根據雞A-FABP基因序列擴增其編碼區序列，并將該序列分別構建到原核表達質粒pGEX-4T-1和真核表達質粒pcDNA3中，得到雞A-FABP基因的原核表達質粒pGEX-4T-1/A-FABP和真核表達質粒pcDNA3/A-FABP。

2、融合蛋白表達及抗血清制備：將原核表達質粒pGEX-4T-1/A-FABP轉入到大腸桿菌感受態細胞BL21(DE)中，利用IPTG誘導其表達雞A-FABP融合蛋白，融合蛋白經純化后免疫家兔制備抗血清。

本發明制備方法得到的雞A-FABP抗血清在特異性鑒定中的應用方法為：

1、抗體特異性檢測：將構建的真核表達質粒pcDNA3/A-FABP通過水動力轉染法注入小鼠體內，使該真核表達質粒在小鼠肝臟中大量表達，8h后取小鼠肝臟提取總蛋白，利用上述制備的抗血清進行抗體特異性分析。