[發明專利]人巨細胞病毒UL122基因的siRNA序列及應用

無效

• 申請號: 200810063310.2
• 申請日: 2008-08-01
• 公開（公告）號: CN101333527A
• 公開（公告）日: 2008-12-31
• 發明（設計）人: 趙正言;尚世強;陶然;段群軍;胡妙鳳
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;A61K31/713;A61P31/20
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司
• 代理人: 張法高;趙杭麗

技術領域

本發明屬于生物技術，涉及分子生物學和基因工程技術領域，具體涉及針對人巨細胞病毒(HCMV)UL122基因的siRNA序列的設計、篩選及其在體內外抑制HCMV的應用。

背景技術

1.HCMV的治療現狀

HCMV屬β皰疹病毒亞科，在人群中感染廣泛，但大多為無癥狀的亞臨床感染。HCMV感染在免疫功能低下的人群(如AIDS、器官移植患者等)中則可引起多系統的嚴重疾病，且可能與多種惡性腫瘤的發生有關。同時，HCMV也是導致先天畸形和新生兒出生缺陷的最主要的感染性因素。因此，防治HCMV感染一直是國內外醫學關注的熱點之一。目前，HCMV的治療藥物主要包括更昔洛韋(ganciclovir，GCV)、膦甲酸鈉(fascarnet，FOS)和西多福韋(cidofovir，CDV)，但是由于藥物毒副作用和HCMV耐藥株的出現，急需探索新的治療途徑控制HCMV感染。

2.UL122基因及其表達蛋白的研究現狀

HCMV的基因組表達具有一定時序性，可分為即刻早期(IE)、早期(E)和晚期(L)三種時相蛋白。主要IE基因UL122經過選擇性剪接產生長度分別為2.25kb(外顯子1，2，3，5)和1.70kb(外顯子1，2，3，5’)的mRNA，分別編碼IE₂86(86kDa，580個aa)和IE₂55(55kDa，425個aa)兩種核磷蛋白。研究表明，UL122基因是HCMV的增殖必需基因，缺失UL122的HCMV突變株不能產生增殖性感染。UL122基因編碼的IE₂86蛋白在病毒復制和調節宿主細胞周期等方面發揮關鍵作用。IE₂86不僅能夠反式激活多種病毒和細胞的啟動子，而且也能作為抑制子下調主要IE蛋白的表達。另外，IE₂86通過多種途徑抑制被感染宿主細胞的凋亡，包括：與凋亡誘導因子p53結合使其失活；通過干擾p53的修飾抑制其激活；阻止不依賴p53的凋亡通路如TNF調節的死亡受體信號途徑；誘導NF-κB轉錄，在適當條件下NF-κB通過誘導cIAPs阻止細胞凋亡。

3.RNA干擾的研究現狀

RNA干擾(RNA?interference，RNAi)是序列特異的雙鏈RNA(dsRNA)使細胞內同源mRNA降解，從而產生特異性基因表達沉默的過程。它是機體的一種小分子RNA介導的序列特異性免疫保護機制，可以對抗侵入性遺傳因子的作用。自1998年首次被報道以來，RNAi技術以其特有的優越性而被迅速應用于抗病毒及其相關方面的研究中，目前已在HIV、HBV、HCV、流感病毒等的抗病毒研究中取得重要進展。

RNAi的作用主要由長約21～23nt的dsRNA介導，其中一類稱為小干擾RNA(small?interfering?RNA，siRNA)，它和目的mRNA序列具有嚴格的配對，能引起相應mRNA降解。由于RNAi是siRNA靶向作用mRNA引起的特異性降解，因此要產生有效RNAi的關鍵是選擇合適的siRNA作用靶點。目前RNAi靶點的選擇原則可以概括為以下幾點：①選擇GC含量在50％左右的mRNA區域；②避免選擇啟動子起始部位下游50～100nt以內或終止子上游50～100nt內的區域；③避免超過三個G或三個C的重疊，因為多聚G或多聚C能形成類聚物而干擾RNAi的沉默機制；④選擇以兩個AA開始的序列，這將使合成siRNA更加容易；⑤保證靶序列與其他基因沒有同源性。目前，制備siRNA的方法主要包括化學合成法、體外轉錄法、長片段dsRNA經RNase?III降解法、siRNA表達載體轉錄法及PCR制備的siRNA表達框法等5種。

發明內容

本發明的目的是提供一種HCMV?UL122基因的siRNA的cDNA序列，其核苷酸序列是：5’-GCATGTTCCGCAACACCAATC-3’。

本發明的另一個目的是提供該cDNA序列在制備治療人巨細胞病毒感染的藥物中的應用。

本發明根據siRNA設計原則，選擇的siRNA其cDNA序列的GC含量為52.4％，對應UL122mRNA中1103-1123核苷酸位點；構建針對HCMV?UL122基因的siRNA真核表達載體，轉化大腸桿菌后提取質粒，轉染AD293細胞，可有效抑制UL122基因mRNA和蛋白表達水平，因此可應用于HCMV治療藥物的制備。