[發明專利]重組金黃色葡萄球菌腸毒素N口服制劑及應用

無效

• 申請號: 200810062477.7
• 申請日: 2008-06-12
• 公開（公告）號: CN101293096A
• 公開（公告）日: 2008-10-29
• 發明（設計）人: 陳樞青;丁丁
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: A61K39/085
• 分類號: A61K39/085;C12N15/31;C12N15/70;C07K14/31;A61P35/00;A61P37/04
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司
• 代理人: 張法高;趙杭麗

技術領域

本發明屬生物工程，涉及重組金黃色葡萄球菌腸毒素N(StaphylococcalEnterotoxin?N，SEN)的制備以及以SEN主要有效成分的口服制劑的制備和在腫瘤治療中的應用。具體地說，就是利用基因工程的方法制備高純度重組金黃色葡萄球菌腸毒素N蛋白及其相關蛋白制品，并將其制備成口服制劑，用于腫瘤患者的治療和康復。

背景技術

金黃色葡萄球菌腸毒素(Staphylococcal?Enterotoxin)由金黃色葡萄球菌產生。目前已經獲得鑒定的腸毒素有二十余種，其中包括經典的腸毒素如SEA、SEB、SEC、SED、SEE等，以及新近發現的腸毒素SEG～SEQ。不同種類腸毒素分子量為25～33kD不等，各類腸毒素氨基酸序列具有一定的同源性(28％～98％)，通過蛋白質晶體衍射以及計算機三維結構模擬技術可知，各類腸毒素的三維結構十分相似，均具有兩個結構域，多數腸毒素包含一個對維持三維結構十分重要的二硫鍵。

金葡菌腸毒素是一類典型的細菌性超抗原，能在短時間內引起宿主體內T細胞的大量增殖與活化。研究發現，腸毒素分子可以以完整分子結合于抗原提呈細胞(Antigen?presenting?cells，APC)表面的MHC-II類分子的抗原肽結合溝槽外側，進而通過與T細胞受體(T?cell?receptor，TCR)Vβ區特異性結合激活T細胞。與普通抗原不同的是，腸毒素不需要同時被TCR分子的Vα、Jα、Jβ、Vβ和Dβ等各部分共同識別，也無MHC-II限制性，使得金葡菌腸毒素只需極低濃度(0.01～10ng/mL)即可激活2～30％的初始T淋巴細胞，是普通抗原激活的T細胞數量的10³～10⁶倍。同時，腸毒素亦能促進受其激活的T細胞分泌多種細胞因子，間接激活B細胞、NK細胞，因此金葡菌腸毒素能高效地刺激和增強免疫應答。

介于此性質，國內外對腸毒素超抗原應用于腫瘤治療的研究已有大量的文獻報導。Frank等人將SEB(10μg/mL)膀胱內灌注荷RT112和RT4細胞小鼠，六周后約76％的小鼠膀胱內腫瘤消失，其余小鼠膀胱內的腫瘤細胞則產生明顯調亡現象。Hedlund等人進行的體內實驗表明，SEA激活T細胞使之增殖作用在每只小鼠0.1-100μg范圍內呈劑量依賴關系，注射后1天出現最大效應，增殖效應維持4天。Litton等人用結腸癌相關抗原C242的單抗Fab片段和SEA制備融合蛋白，證明該融合蛋白在體內能夠高效地促進T細胞和單核細胞在腫瘤組織處聚集、滲透，并誘導T細胞產生大量細胞因子，同時誘導結腸癌細胞產生IL-4、IL-10、TNF-α等細胞因子，并引起癌細胞IFN-γ受體、Fas受體表達上調，從而有效誘導腫瘤細胞調亡。Kodama等制備了SEA的突變體mSEAD227A，該突變蛋白與天然SEA相比降低了與MHC-II分子的結合能力，但未改變對T細胞的刺激增殖能力。實驗證明家兔對該突變體的耐受力是天然SEA的500倍。利用該突變蛋白與抗MUC1抗原的單克隆抗體MUSE11制備融合蛋白，證明該融合蛋白在體內和體外均能高效地增強T-LAK細胞對表達MUC1的膽管癌細胞的特異性細胞毒作用。

在國外，以金葡菌腸毒素及其融合蛋白為主要有效成分的藥物已經進入了臨床研究。如Giantonio等人完成的PNU-214565(重組SEA與C242單克隆抗體的Fab片段制備的融合蛋白)的I期臨床實驗表明，患者可能產生的細胞毒性與給藥劑量密切相關，而給藥劑量又取決于患者的體重和血液循環中抗SEA抗體濃度。在給藥過程中，76％的患者出現不同程度的體溫升高，62％的患者出現不同程度的血壓降低，其主要因素是誘導產生的IL-2和TNF，毒副作用均為暫時性的，容易得到控制。他們發現，治療開始之前病人體內抗SEA抗體在一定程度上降低了毒副反應，通過綜合考慮個體體重與抗SEA抗體濃度，可以確定一個副作用最小的給藥劑量。Jonathan等人完成了PNU-214565的第二代產品PNU-214936的I期臨床實驗，目的為了在非小細胞肺癌(non-small-cell?lung?cancer，NSCLC)患者身上實現個體化給藥，并使用Bayesian模型結合過量劑量控制方法進行劑量放大，確定了該藥的最大耐藥劑量(MTD)。