[發明專利]大麥黃矮病毒干擾病毒基因表達載體及其構建方法與應用

無效

• 申請號: 200810056509.2
• 申請日: 2008-01-21
• 公開（公告）號: CN101215572A
• 公開（公告）日: 2008-07-09
• 發明（設計）人: 王錫鋒;吳蓓蕾;劉艷;周廣和
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院植物保護研究所
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/40;A01H1/00
• 代理公司: 北京海虹嘉誠知識產權代理有限公司
• 代理人: 張濤

1.一種大麥黃矮病毒干擾病毒基因表達載體，其特征是采用的骨架載體是pMCG161，在其上游的兩個酶切位點AscI、AvrII間插入大麥黃矮病毒外殼蛋白基因的正義鏈，在下游的兩個酶切位點SpeI、SgfI間插入其大麥黃矮病毒外殼蛋白基因的反義鏈。

2.根據權利要求1所述的大麥黃矮病毒干擾病毒基因表達載體，所述大麥黃矮病毒是大麥黃矮病毒GAV。

3.權利要求2所述的大麥黃矮病毒干擾病毒基因表達載體的構建方法，包括如下步驟：

(1)設計大麥黃矮病毒GAV外殼蛋白CP基因的引物：

SEQ?NO?1：5′ATGAATTCAGTAGGCCGTAGA?3′，

SEQ?NO?2：5′CTATTTGGGAGTCATGTTGGC?3′，

以BYDV-GAV的總RNA為模板，經RT-PCR擴增全長CP基因片段，回收目的片段后克隆得到CP基因陽性克隆，

(2)設計帶有四個酶切位點AscI、AvrII、SpeI和SgfI的全長CP基因的RNA干擾引物：

SEQ?NO?3：5′CTACTAGTGGCGCGCCATGAATTCAGTAGGCCGTAGA?3′，

SEQ?NO?4：5′CGGCGATCGCCTAGGCTATTTGGGAGTCATGTTGGC?3′，

以CP基因陽性克隆為模板，經RT-PCR擴增介導RNA干擾的BYDV-GAV外殼蛋白的前體雙鏈DNA，目的片段回收后，得到含目的片段的陽性質粒，

(3)含目的片段的陽性質粒經AscI、AvrII酶切得到正義鏈，經SpeI、AsiSI得到反義鏈，

(4)pMCG161首先經AscI、AvrII酶切成線性片斷，將正義鏈連接到pMCG161載體的AscI和AvrII位點，將反義鏈連接到pMCG161載體的SpeI和SgfI位點，最終構建成干擾載體。

4.根據權利權利3所述的構建軍方法，所述克隆獲取含目的片段的陽性質粒所用的載體pGEM?T-easy載體，轉化菌株為大腸桿菌JM110。

5.權利要求1或2所述的大麥黃矮病毒干擾病毒基因表達載體的應用。

6.根據權利要求5所述的應用，是將大麥黃矮病毒干擾病毒基因表達載體轉化有關受體植物使之對大麥黃矮病毒產生抗性。

7.根據權利要求6所述的應用，所述轉化方法為基因槍法、農桿菌介導法或共轉化法。

8.根據權利要求7所述的應用，所述轉化方法為基因槍法。

9.根據權利要求6所述的應用，所述受體植物為禾本科植物。

10.根據權利要求9所述的應用，所述禾本科植物為小麥。