[發(fā)明專(zhuān)利]一種抗雞傳染性法氏囊病毒轉(zhuǎn)移因子的制備方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200810053543.4
• 申請(qǐng)日: 2008-06-17
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101293914A
• 公開(kāi)（公告）日: 2008-10-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 田杏芳;王連民
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 天津生機(jī)集團(tuán)股份有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C07K1/14
• 分類(lèi)號(hào): C07K1/14;C07K1/34;A61P31/14
• 代理公司: 天津市三利專(zhuān)利商標(biāo)代理有限公司
• 代理人: 閆俊芬

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及藥物及其制劑領(lǐng)域，更具體地說(shuō)，是涉及一種抗雞傳染性法氏囊病毒轉(zhuǎn)移因子的制備方法。

背景技術(shù)

雞傳染性法氏囊病又稱(chēng)雞傳染性腔上囊病，是由傳染性法氏羹病毒引起的一種急性、接觸傳染性疾病。以法氏囊發(fā)炎、壞死、萎縮和法氏囊內(nèi)淋巴細(xì)胞嚴(yán)重受損為特征。從而引起雞的免疫機(jī)能障礙，干擾各種疫苗的免疫效果。發(fā)病率高，幾乎達(dá)100％，死亡率低，一般為5％～15％，是目前養(yǎng)禽業(yè)最重要的疾病之一。自然條件下，本病只感染雞，所有品種的雞均可感染，但不同品種的雞中，白來(lái)航雞比重型品種的雞敏感，肉雞較蛋雞敏感。本病僅發(fā)生于2周至開(kāi)產(chǎn)前的小雞，3～7周齡為發(fā)病高峰期。雛雞群突然大批發(fā)病，2～3天內(nèi)可波及60％～70％的雞，發(fā)病后3～4天死亡達(dá)到高峰，7～8天后死亡停止。病初精神沉郁，采食量減少，飲水增多，有些自啄肛門(mén)，排白色水樣稀糞，重者脫水，臥地不起，極度虛弱、最后死亡。耐過(guò)雛雞貧血消瘦，生長(zhǎng)緩慢。

盡管目前已經(jīng)有一些抗雞傳染性法氏囊病毒的藥品或制劑：但是由于現(xiàn)有藥品制劑的針對(duì)性不強(qiáng)，療效有限，而且，治療性制劑多是在發(fā)病后才應(yīng)用的，不能起預(yù)防作用。對(duì)于雞傳染性法氏囊病的易感雞群，每年定期對(duì)雞接種雞傳染性法氏囊疫苗是預(yù)防雞傳染性法氏囊的有效方法。其次應(yīng)增強(qiáng)營(yíng)養(yǎng)或藥物干預(yù)，提高自身免疲力。通過(guò)藥物提高機(jī)體抵杭力或調(diào)節(jié)免疫力也是一種預(yù)防雞傳染性法氏囊的有效方法，轉(zhuǎn)移因子可起到此作用。

轉(zhuǎn)移因子(TF，Transfer?Factor)是T淋巴細(xì)胞釋放的一種能夠轉(zhuǎn)移致敏信息的低分子量多肽-核苷酸復(fù)合物，它能將供體的某種特定的細(xì)胞免疫功能特異地轉(zhuǎn)移給受體正常的淋巴細(xì)胞，參與機(jī)體的免疫反應(yīng)，提高受體機(jī)體的細(xì)胞免疫功能，抵抗真菌、病毒等非細(xì)菌性感染；同時(shí)促進(jìn)B淋巴細(xì)胞的抗體分泌作用，能夠誘導(dǎo)細(xì)胞釋放干擾素和白介素，從而增強(qiáng)受體的免疫功能。

目前已報(bào)道的轉(zhuǎn)移因子的提取方法都是關(guān)于非特異性轉(zhuǎn)移因子的制備方法。例如，中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)“制備轉(zhuǎn)移因子的工藝方法——全濾法”(專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)枺?00310118439.6)則公開(kāi)了采用壓濾、超濾、納濾幾種方法連續(xù)過(guò)濾的制備工藝。另一份中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)“制備轉(zhuǎn)移因子的工藝方法——加熱法”(專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)枺?00410039444.2)是由同一申請(qǐng)人在前一份申請(qǐng)的基礎(chǔ)上加上加熱處理的步驟，仍然是連續(xù)采用多種過(guò)濾法的制備工藝。上述專(zhuān)利申請(qǐng)的內(nèi)容是對(duì)破碎后的組織經(jīng)冷凍離心后直接進(jìn)行過(guò)濾提取，同樣存在細(xì)胞破碎不完全的缺陷，而且其工藝煩瑣，時(shí)間較長(zhǎng)，對(duì)產(chǎn)物的活性損失也較大，因此得率很難提高。

豬脾臟和胸腺是免疫活性細(xì)胞聚集的場(chǎng)所，而且材料來(lái)源非常廣泛，因此從這類(lèi)細(xì)胞中提取特異性轉(zhuǎn)移因子，有重要的理論意義和現(xiàn)實(shí)意義，但目前尚未見(jiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是，克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，提供一種天然高效純生物活性物質(zhì)抗雞傳染性法氏囊病毒轉(zhuǎn)移因子的制備方法。

本發(fā)明抗雞傳染性法氏囊病毒轉(zhuǎn)移因子的制備方法，按照以下步驟進(jìn)行：

(1)制備病毒抗原：將雞傳染性法氏囊病毒接種于10天齡雞胚尿囊液，33℃下48-72小時(shí)，取雞胚尿囊液，裝厚壁小瓶子內(nèi)，超聲打碎，5000rpm離心20分鐘，棄去沉渣留上清；

(2)提取病毒抗原：取離心上清，然后不連續(xù)梯度密度離心純化提取病毒抗原；將病毒抗原離心后，取上清液裝入以15％、30％、45％及60％的蔗糖制備的不連續(xù)梯度密度離心管，超速離心，165000轉(zhuǎn)/分3小時(shí)，根據(jù)雞傳染性法氏囊病毒的分子量確定雞傳染性法氏囊病毒所在離心管位置，吸出備用；

(3)用上述提取的病毒抗原免疫豬：挑選健康免疫豬，取制備的病毒抗原，用上述提取病毒抗原皮下多點(diǎn)注射免疫豬，共免疫3-4次，前兩次分別以完全佛氏佐劑及不完全佛氏佐劑混合抗原，以高速組織勻漿機(jī)打勻，在動(dòng)物皮內(nèi)或皮下多點(diǎn)注射免疫，第3次和第4次后在動(dòng)物的肌肉或靜脈注射，每次免疫間隔一周，最后一次免疫7-10天后取動(dòng)物靜脈血，以免疫熒光方法或ELISA方法檢測(cè)上述病毒的特異性抗體效價(jià)，出現(xiàn)病毒特異性免疫效價(jià)后，宰殺動(dòng)物，取脾臟和胸腺于冰上，轉(zhuǎn)移至-20℃保存，備用；

(4)從免疫豬中提取抗雞傳染性法氏囊病毒轉(zhuǎn)移因子：

①原材料的制備及預(yù)處理：將上述接種病毒免疫豬的脾及淋巴結(jié)組織，用冷三蒸水洗凈豬脾，去其表面的筋膜、脂肪等組織，再滅菌生理鹽水反復(fù)沖洗；

②破碎：將洗干凈的豬脾臟剪碎，加入2倍體積的冷生理鹽水，在冰凍的條件下用高速組織搗碎機(jī)以1000r/min搗碎3次，每次3min，制得勻漿液；