[發(fā)明專利]一種新型柴胡皂苷糖苷酶及其制備方法和應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200810052927.4
• 申請日: 2008-04-29
• 公開（公告）號: CN101570746A
• 公開（公告）日: 2009-11-04
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 魚紅閃;金鳳燮;閆希軍;朱永宏;周水平
• 申請（專利權(quán)）人: 天津天士力制藥股份有限公司
• 主分類號: C12N9/38
• 分類號: C12N9/38;C12P17/04;C12R1/01;C12R1/465;C12R1/685;C12R1/69;C12R1/645
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1.一種柴胡皂苷糖苷酶的酶解代謝產(chǎn)物的制備方法，包括以下步驟：

(1)微生物發(fā)酵方法：采用液態(tài)發(fā)酵法或固態(tài)發(fā)酵法，其中所述液態(tài)發(fā)酵法是指產(chǎn)酶時加入 相當(dāng)于培養(yǎng)基0.01％-1％的柴胡皂苷誘導(dǎo)物、或者相當(dāng)于培養(yǎng)基0.1％-3％柴胡提取物，發(fā)酵培 養(yǎng)2-8天、離心除渣，得到粗酶液；固態(tài)發(fā)酵法是加入培養(yǎng)基1％-30％柴胡，培養(yǎng)2-8天，用 緩沖液浸出、離心除渣得粗酶液；所述微生物為鏈霉菌；

(2)向粗酶液中加入60-75％飽和硫酸銨沉淀酶蛋白，收集沉淀再用原酶液的1/5-1/10的 濃度0.001-0.5M，pH為3-10的緩沖液溶解，離心除渣得到酶的濃縮液；

(3)粗酶濃縮液還經(jīng)離子交換樹脂柱和/或蛋白制備色譜儀分離提純，得到在SDS電泳上單 一帶的純柴胡皂苷糖苷酶，所述柴胡皂苷糖苷酶的蛋白質(zhì)分子量為3.0-9.0萬；

(4)上述柴胡皂苷糖苷酶與0.01％-10％底物的pH3～9緩沖液混合在4～75℃，反應(yīng)4～40小時 后，提取酶解代謝產(chǎn)物。

2.如權(quán)利要求1中所述的制備方法，其特征在于：步驟(1)中所述液態(tài)發(fā)酵法是指產(chǎn)酶時 加入相當(dāng)于培養(yǎng)基0.05％-0.3％的柴胡皂苷；或相當(dāng)于培養(yǎng)基0.3％-1％柴胡提取物；固態(tài)發(fā) 酵法是加入培養(yǎng)基10％-20％柴胡藥材。

3.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于：步驟(3)中所述的柴胡皂苷糖苷酶的蛋白 質(zhì)分子量為5.0-8.0萬。

4.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于：步驟(4)中所述的底物濃度為濃度0.5-4％。

5.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于：步驟(4)所述底物為柴胡總皂苷，酶解代 謝產(chǎn)物為含有單糖基柴胡皂苷或苷元的混合柴胡總皂苷。

6.如權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于：所述步驟(4)取0.1-6％柴胡總皂苷的pH5～ 6緩沖液與柴胡皂苷糖苷酶充分混合，在55～65℃，反應(yīng)時間18～28小時，加入2-4倍 體積酒精，沉淀酶蛋白，離心除酶蛋白，其上清液經(jīng)樹脂或硅膠吸附，75-95％乙醇洗脫， 洗脫物減壓干燥后即得柴胡總皂苷。

7.如權(quán)利要求1所述代謝產(chǎn)物的制備方法，其特征在于：步驟(4)所述底物為柴胡皂苷， 酶解代謝產(chǎn)物為單糖基柴胡皂苷或苷元。

8.權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于：所述步驟(4)取柴胡皂苷pH4～7緩沖液與 柴胡皂苷糖苷酶混合在35～60℃，反應(yīng)15～24小時；離心除酶蛋白，其上清液經(jīng)樹脂或硅 膠吸附，用50-95％乙醇洗脫提取，提取單糖基柴胡皂苷或苷元。

9.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于：步驟(4)所述底物為柴胡藥材，酶解代謝 產(chǎn)物為含有單糖基柴胡皂苷或苷元含量高的柴胡藥材。

10.如權(quán)利要求9所述的制備方法，其特征在于：所述步驟(4)取柴胡藥材或粉末與酶混合， 在35～60℃，pH4～6，反應(yīng)18～28小時后，離心除酶蛋白，干燥，得單糖基柴胡皂苷含 量高的藥材。