[發(fā)明專利]牛蛙抗菌肽temporin-La及其基因和在制藥中的應(yīng)用

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200810051638.2
• 申請(qǐng)日: 2008-12-22
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101475630A
• 公開(kāi)（公告）日: 2009-07-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 韓文瑜;趙瑞利;雷連成;韓俊友;馮新;孫長(zhǎng)江
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 吉林大學(xué)
• 主分類號(hào): C07K7/08
• 分類號(hào): C07K7/08;C12N15/12;A61K38/10;A61P31/00;A61P35/00
• 代理公司: 吉林長(zhǎng)春新紀(jì)元專利代理有限責(zé)任公司
• 代理人: 陳宏偉

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種牛蛙抗菌肽temporin-La及其基因和在制藥中的應(yīng)用，屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。?

背景技術(shù)

抗菌肽作為一種全新概念的、廣譜抗菌蛋白類抗生素將具有比傳統(tǒng)抗生素更加廣闊的市場(chǎng)前景，有希望成為新一代抗菌劑，其研制目前受到廣泛重視。目前已從不同的無(wú)尾目動(dòng)物皮膚中分離到300多條不同的抗菌肽，并且其數(shù)目還在增加。來(lái)自中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所生物毒素系的研究人員在Odorrana?grahami(無(wú)指盤(pán)臭蛙，一種兩棲動(dòng)物)中發(fā)現(xiàn)了107種新型的抗菌肽(antimicrobial?peptides)，并進(jìn)行了抗菌機(jī)制研究，這比目前報(bào)道的兩棲類抗菌肽數(shù)目多了三倍，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最豐富的抗菌肽資源，這也為抗菌機(jī)制研究提供了重要信息。?

在中國(guó)，很多兩棲類動(dòng)物被作為傳統(tǒng)中藥和民族藥物而廣泛應(yīng)用，如中華蟾蜍(Bufogargarizans)等。這些兩棲類動(dòng)物的皮膚和內(nèi)臟具有廣泛的藥理活性和臨床療效。已報(bào)道藥理活性有廣譜抗微生物作用、抗腫瘤、鎮(zhèn)痛、局部麻醉、免疫調(diào)節(jié)、心血管系統(tǒng)作用等。據(jù)國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道，已從各種生物來(lái)源分離得到不同的活性多肽，而且有些已進(jìn)入臨床治療。例如將esculentin-1基因轉(zhuǎn)入到煙草中，在其體液中檢測(cè)到有活性的esculentin-1的存在，同時(shí)這種植物對(duì)細(xì)菌以及真菌的抵抗力明顯增強(qiáng)；從爪蟾(Xenopuslaevis)皮膚分泌液獲得的抗菌肽Magainin具光譜抗微生物作用，同時(shí)具有抗腫瘤活性，在美國(guó)已獲準(zhǔn)作為廣譜抗菌藥物，其基因工程產(chǎn)品已進(jìn)入三期臨床。?

我國(guó)對(duì)兩棲類藥物的應(yīng)用有悠久的歷史，但對(duì)其活性成分和藥理性質(zhì)的研究主要集中于生物堿等有機(jī)小分子，對(duì)其皮膚活性肽類物質(zhì)的研究不多。?

發(fā)明人將本發(fā)明的牛蛙抗菌肽全序列氨基酸結(jié)構(gòu)經(jīng)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，未發(fā)現(xiàn)有任何相同多肽。?

發(fā)明內(nèi)容：

本發(fā)明的目的在于提供一種牛蛙抗菌肽temporin-La，為一種新的牛蛙抗菌肽，具有藥理活性。?

本發(fā)明還進(jìn)一步提供了牛蛙抗菌肽temporin-La在制藥中的應(yīng)用，制備病原微生物感染疾病的治療藥物和腫瘤治療藥物。?

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：?

牛蛙抗菌肽是由無(wú)尾兩棲類牛蛙抗菌肽基因編碼的一種單鏈多肽，分子量為1623.08道爾頓，等電點(diǎn)為9.70，多肽全序列一級(jí)結(jié)構(gòu)為：Leu?Leu?Arg?His?Val?Val?Lys?IleLeu?Glu?Lys?Tyr?Leu-AMIDATION。?

牛蛙抗菌肽基因的克隆包括：?

牛蛙皮膚總RNA的提取，mRNA的純化，mRNA的反轉(zhuǎn)錄及cDNA文庫(kù)構(gòu)建，設(shè)計(jì)引物利用PCR方法篩選牛蛙抗菌肽基因。擴(kuò)增引物長(zhǎng)度為20個(gè)核苷酸，其序列為-ATGTTCACCWTGAAGAAATC-3′，PCR另一擴(kuò)增引物為CLONTECH公司SMART^TMcDNA?Library?Construction?Kit中的5′PCR?Primer引物，其序列為5′-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCC-3′。所獲陽(yáng)性單克隆進(jìn)行核苷酸序列測(cè)定。測(cè)序結(jié)果表明牛蛙抗菌肽的基因由324個(gè)核苷酸組成，自5′端至3′端序列為：?

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編碼牛蛙成熟抗菌肽為第142-180位核苷酸，其氨基酸序列為：?

Leu?Leu?Arg?His?Val?Val?Lys?Ile?Leu?Glu?Lys?Tyr?Leu-AMIDATION?