[發(fā)明專利]MUC1串聯(lián)重復序列多肽及其制備工藝以及作為抗腫瘤藥物的應用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200810051351.X
• 申請日: 2008-10-29
• 公開（公告）號: CN101412749A
• 公開（公告）日: 2009-04-22
• 發(fā)明（設計）人: 臺桂香;柳忠輝
• 申請（專利權）人: 臺桂香
• 主分類號: C07K7/08
• 分類號: C07K7/08;C07K14/47;C12N15/12;C12N15/70;A61K38/10;A61K38/17;A61P35/00
• 代理公司: 吉林長春新紀元專利代理有限責任公司
• 代理人: 陳宏偉

技術領域：

本發(fā)明公開一種MUC1串聯(lián)重復序列多肽及其制備工藝，本發(fā)明還提供了該多 肽作為抗腫瘤藥物的應用，屬于腫瘤治療技術領域。

背景技術：

MUC1是mucin黏蛋白家族成員之一，由多肽骨架(核芯肽)和側枝糖鏈構成。 MUC1的多肽骨架由胞外段、跨膜段和胞內段三部分組成。胞外段含有數(shù)目不等的串 聯(lián)重復序列(variable?number?of?tandem?repeats，VNTRs)，每個重復序列含有20個氨 基酸，即SAPDTRPAPGSTAPPAHGVT。不同個體的VNTRs數(shù)量從20-125不等。

MUC1主要分布在上皮細胞及其來源的腫瘤細胞(乳腺癌、卵巢癌、肺癌、胰腺 癌等)以及多種血液腫瘤細胞表面。正常組織MUC1與腫瘤組織不同，前者糖基化豐 富，與免疫細胞相對隔離；而后者異常豐富地表達于癌細胞表面，糖基化不完全，因 此暴露出正常情況下隱蔽的表位，成為免疫細胞攻擊的靶點^]。

MUC1生物學功能除潤滑、保護及調節(jié)細胞間的粘附等機械作用外，MUC1作為 一個癌基因可導致正常細胞轉化。對可溶性MUC1的研究發(fā)現(xiàn)其具有免疫抑制的作用。 在高表達MUC1腺癌患者體液中可發(fā)現(xiàn)較高含量的可溶性MUC1，可溶性MUC1一部 分可能來源于腫瘤細胞表面MUC1脫落，另一部分可能來源于選擇性地RNA剪切。 研究發(fā)現(xiàn)腫瘤來源的可溶性MUC1不能被DC細胞提呈，限制了Th1的活化，從而使 腫瘤細胞逃逸免疫系統(tǒng)的監(jiān)視。經檢索相關技術文獻，MUC1多肽對腫瘤細胞直接作 用未見文獻報道。

發(fā)明內容：

本發(fā)明公開一種MUC1串聯(lián)重復序列多肽，

本發(fā)明還提供了上述MUC1串聯(lián)重復序列多肽的制備工藝，適用于工業(yè)化生產。

本發(fā)明進一步提供了該多肽作為抗腫瘤藥物的應用，通過體外和體內試驗證實 MUC1串聯(lián)重復序列的多肽能抑制腫瘤細胞增殖，具有抗腫瘤作用。

本發(fā)明MUC1串聯(lián)重復序列多肽，為MUC1多肽骨架的串聯(lián)重復序列20個氨基 酸組成的1～10個串聯(lián)重復，分子量大約1.87KD～18.7KD。

串聯(lián)重復的20個氨基酸序列：SAPDTRPAPGSTAPPAHGVT

串聯(lián)重復可從上述排列中任何一個氨基酸起始合成。

本發(fā)明MUC1串聯(lián)重復序列多肽的制備工藝，包括以下步驟：

采用MUC1多肽骨架中20個氨基酸串聯(lián)重復序列，選擇1～10個串聯(lián)重復序列 的cDNA片段連入pGEX-4T-1載體，然后將重組質粒轉化大腸桿菌DH5α；經氨芐青 霉素篩選轉化菌落，通過酶切及基因測序分析插入片段；將重組質粒轉化大腸桿菌 DH5α，通過0.3mM?IPTG誘導表達，通過篩選獲得穩(wěn)定的表達菌株 pGEX-MUC1/DH5α；煮沸裂解少量細菌，經10％SDS-PAGE分析MUC1-GST融合蛋 白的表達，通過Western?blotting鑒定特異的表達條帶；大量培養(yǎng)的工程菌，超聲破碎 后留取上清通過Glutathione--Sepharose?4B親和層純化人MUC1-GST融合蛋白；再通 過凝血酶裂解獲得純的MUC1多肽.將MUC1多肽做成藥物制劑。

本發(fā)明MUC1串聯(lián)重復序列多肽在制備抗腫瘤藥物中的應用：MUC1核芯肽的20 個氨基酸串聯(lián)重復序列多肽不僅在體外能抑制許多腫瘤細胞增殖，而且體內實驗也可 抑制腫瘤生長。

本發(fā)明的積極效果在于首次發(fā)現(xiàn)MUC1串聯(lián)重復序列多肽不僅能抑制血液腫瘤的 增殖，而且還能抑制實體瘤細胞的增殖，并且能抑制體內腫瘤的生長。為腫瘤治療提 供新的藥物。

本發(fā)明適用于下述醫(yī)療用途：

1.治療淋巴細胞白血病

2、治療粒細胞白血病

3、治療肝癌

4、治療表達MUC1蛋白的各種惡性腫瘤

下述的實驗證實了MUC1具有抗腫瘤作用：

實驗例1

1.主要試劑與材料

新生牛血清(NCS)購自杭州四季青公司，IMDM購于Gibico公司。MUC1多肽 (130氨基酸)為本室制備。錐蟲藍(Trypan?Blue)購于美國Sigma公司。

2.1?細胞培養(yǎng)