[發(fā)明專利]從大腸桿菌中制備純化Exendin-4的工藝

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200810049811.5
• 申請日: 2008-05-19
• 公開（公告）號: CN101586138A
• 公開（公告）日: 2009-11-25
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王小純;祖向陽;陳紅歌
• 申請（專利權(quán)）人: 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12P21/02
• 分類號: C12P21/02;C07K1/14
• 代理公司: 鄭州中原專利事務(wù)所有限公司
• 代理人: 張紹琳

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及Exendin-4的純化工藝，具體涉及一種從大腸桿菌中制備純 化Exendin-4的工藝。

背景技術(shù)

利用基因工程方法制備有經(jīng)濟(jì)價值的蛋白質(zhì)成功的關(guān)鍵在于，其一是篩 選高產(chǎn)菌株，其二在于優(yōu)化純化方案，提高目的蛋白的純度和產(chǎn)量。二者缺 一不可。尤其是象Exendin-4，含39個氨基酸殘基、分子量僅4.2kD的小蛋 白純化難度更大。由于其極高的經(jīng)濟(jì)價值(7000元/mg，2-型糖尿病治療的特 效新藥)以及將來用于工業(yè)化生產(chǎn)，從大腸桿菌中制備純化Exendin-4的工 藝極為重要，因?yàn)樗鼪Q定了Exendin-4的產(chǎn)量、純度及工業(yè)化生產(chǎn)的可行性。 Qiagene及Invitrogen兩大國際生物公司建立了從大腸桿菌中制備目的蛋白的 純化工藝，包括細(xì)菌培養(yǎng)、裂解、親和層析純化目的蛋白和用腸激酶切除N 端融合肽等，由于該工藝在裂解液配方、洗脫液配方和洗脫方法上還存在不 足，因此用該方法純化的目的蛋白，尤其是Exendin-4的產(chǎn)量和純度均不能 令人滿意。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種操作工藝簡單的 從大腸桿菌中制備純化Exendin-4的工藝，用該工藝能獲得高純度、高產(chǎn)量 的Exendin-4。

本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

(一)Exendin-4高產(chǎn)工程菌株的構(gòu)建方法：

(1)經(jīng)改造得到如SEQ?ID?No.1所示Exendin-4基因；人工合成Exendin-4基 因，采用PCR方法，以5′GGTACCGACGACGACGACAAGC?3′為正向引物，以 5′CCATGGTTATCAAGATGGTGGCG?3′為反向引物，在SEQ?ID?No.I所示的 Exendin-4基因5′端加上限制性內(nèi)切酶Kpn?I識別位點(diǎn)；在Kpn?I識別位點(diǎn)后添加 編碼腸激酶識別位點(diǎn)DDDDK的核酸序列GACGACGACGACAAG，使腸激酶識 別位點(diǎn)的核酸序列與Exendin-4基因緊密相連；在SEQ?ID?No.I所示的Exendin-4 基因3′端添加兩個相連的終止密碼子TGATAA和限制性內(nèi)切酶Nco?I識別位點(diǎn) CCATGG；

(2)克隆載體pMD19-T-Exendin-4的構(gòu)建：利用PCR擴(kuò)增步驟(1)所述 的改造后的Exendin-4基因，純化后與pMD19-T載體連接，構(gòu)建克隆載體 pMD19-T-Exendin-4；

(3)高效表達(dá)載體pET-32a(+)-Exendin-4的構(gòu)建：用限制性內(nèi)切酶Kpn? I和Nco?I雙酶切pMD19-T-Exendin-4質(zhì)粒，回收目的片斷；用限制性內(nèi)切酶Kpn? I和Nco?I消化表達(dá)載體質(zhì)粒pET-32a(+)，回收載體pET-32a(+)大片段，將 二者連接即得到重組Exendin-4表達(dá)載體pET-32a(+)-Exendin-4；將表達(dá)載體 pET-32a(+)-Exendin-4轉(zhuǎn)化入大腸桿菌工程菌BL21(DE3)pLYS中，得到 Exendin-4高產(chǎn)工程菌株BL21(DE3)pLYS-pET-32a(+)-Exendin-4。

(二)從大腸桿菌中制備純化Exendin-4的工藝：

(1)一個單克隆接種于200ml?AMP-LB培養(yǎng)基，25℃過夜靜置培養(yǎng)12h； 然后在37℃，220rpm條件下培養(yǎng)至菌液OD₆₀₀達(dá)到0.6后，置于冰上冷卻， 加入IPTG至濃度為1mM，在30℃、220rpm條件下誘導(dǎo)6h，收獲菌液于- 20℃保存?zhèn)溆谩?

(2)將步驟(1)保存的菌液于冰上融化后，每克細(xì)菌用10ml裂解液懸 浮沉淀冰浴30min，超聲波破碎；所用裂解液的組成為：50mM?NaH₂PO4、 500mM?NaCl、10mM咪唑、0.01％Trition?100、2％甘油、10mMβ-巰基乙醇、 0.1％PMSF、1mM?MgCl₂、1U?RNase、1U?DNase。

(3)將上述裂解液于4℃，8000rpm離心30min；將上清液與樹脂按2∶1 混合，4℃緩慢振蕩吸附3h；4℃，3000rpm離心5min，棄去上清。