[發明專利]從大腸桿菌中制備純化Exendin-4的工藝

無效

• 申請號: 200810049811.5
• 申請日: 2008-05-19
• 公開（公告）號: CN101586138A
• 公開（公告）日: 2009-11-25
• 發明（設計）人: 王小純;祖向陽;陳紅歌
• 申請（專利權）人: 河南農業大學
• 主分類號: C12P21/02
• 分類號: C12P21/02;C07K1/14
• 代理公司: 鄭州中原專利事務所有限公司
• 代理人: 張紹琳

1.一種從大腸桿菌中制備純化Exendin-4的工藝，其特征在于它是按下 述步驟進行的：

(一)Exendin-4高產工程菌株的構建方法：

(1)經改造得到如SEQ?ID?No.1所示Exendin-4基因；人工合成Exendin-4基 因，采用PCR方法，以5′GGTACCGACGACGACGACAAGC?3′為正向引物，以 5′CCATGGTTATCAAGATGGTGGCG?3′為反向引物，在SEQ?ID?No.I所示的 Exendin-4基因5′端加上限制性內切酶Kpn?I識別位點；在Kpn?I識別位點后添加 編碼腸激酶識別位點DDDDK的核酸序列GACGACGACGACAAG，使腸激酶識 別位點的核酸序列與Exendin-4基因緊密相連；在SEQ?ID?No.I所示的Exendin-4 基因3′端添加兩個相連的終止密碼子TGATAA和限制性內切酶Nco?I識別位點 CCATGG；

(2)克隆載體pMD19-T-Exendin-4的構建：利用PCR擴增步驟(1)所述 的改造后的Exendin-4基因，純化后與pMD19-T載體連接，構建克隆載體 pMD19-T-Exendin-4；

(3)高效表達載體pET-32a(+)-Exendin-4的構建：用限制性內切酶Kpn? I和Nco?I雙酶切pMD19-T-Exendin-4質粒，回收目的片斷；用限制性內切酶Kpn? I和Nco?I消化表達載體質粒pET-32a(+)，回收載體pET-32a(+)大片段，將 二者連接即得到重組Exendin-4表達載體pET-32a(+)-Exendin-4；將表達載體 pET-32a(+)-Exendin-4轉化入大腸桿菌工程菌BL21(DE3)pLYS中，得到 Exendin-4高產工程菌株BL21(DE3)pLYS-pET-32a(+)-Exendin-4；

(二)從大腸桿菌中制備純化Exendin-4的工藝：

(1)一個單克隆接種于200ml?AMP-LB培養基，25℃過夜靜置培養12h； 然后在37℃，220rpm條件下培養至菌液OD₆₀₀達到0.6后，置于冰上冷卻， 加入IPTG至濃度為1mM，在30℃、220rpm條件下誘導6h，收獲菌液于- 20℃保存備用；

(2)將步驟(1)保存的菌液于冰上融化后，每克細菌用10ml裂解液懸 浮沉淀，冰浴30min，超聲波破碎；所用裂解液的組成為：50mM?NaH₂PO4、 500mM?NaCl、10mM咪唑、0.01％?Trition?100、2％甘油、10mMβ-巰基乙醇、 0.1％?PMSF、1mM?MgCl₂、1U?RNase、1U?DNase；

(3)將上述裂解液于4℃，8000rpm離心30min；取上清液與Ni-樹脂 按2∶1混合，4℃緩慢振蕩吸附3h；4℃，3000rpm離心5min，棄去上清；

(4)向步驟(3)的樹脂中加入細菌裂解液4倍體積的漂洗緩沖液，4℃ 緩慢振蕩30min；4℃，3000rpm離心5min，棄上清；用1倍細菌裂解液體積 的漂洗緩沖液重懸浮樹脂，轉移到層析柱中；收集漂洗緩沖液最后1.5ml，用 于鑒定洗液中是否還有雜蛋白；漂洗緩沖液組成為：50mM?NaH₂PO₄；500mM NaCl；20mM咪唑；pH?8.0；

(5)先用洗脫液I以1.5ml/min的流速洗脫，收集洗脫液I；再用洗脫 液II以1.5ml/min的流速洗脫，收集洗脫液II得到純化融合蛋白；所用洗脫液 I的組成為：50mM?NaH₂PO₄、500mM?NaCl、40mM咪唑、2％甘油、10mMβ- 巰基乙醇；所用洗脫液II的組成為：50mM?NaH₂PO₄、500mM?NaCl、80mM咪 唑、2％甘油、10mMβ-巰基乙醇；所用洗脫液I的體積為11ml，收集6.5ml 后，再分部收集3管，每管1.5ml；所用洗脫液II的體積為9ml，每管1.5ml， 共收集6管；

(6)每3mg重組Exendin-4加入1U腸激酶，4℃消化6h，將酶消化液 與Ni-樹脂混合后吸附3h后，過層析柱得到的洗脫液即為純化的Exendin-4 溶液。