[發(fā)明專利]一種重組植酸酶基因表達載體及轉(zhuǎn)植酸酶基因乳酸桿菌

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200810049164.8
• 申請日: 2008-01-28
• 公開（公告）號: CN101463360A
• 公開（公告）日: 2009-06-24
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 尹清強;左瑞雨;馮華;鄭秋紅;路玲
• 申請（專利權(quán)）人: 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/55;C12N9/16;C12N1/21;C12R1/225
• 代理公司: 鄭州中原專利事務(wù)所有限公司
• 代理人: 張 春

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及構(gòu)建植酸酶基因與pIAβ8連接一起的高效表達載體及植酸酶基因在乳酸桿菌中的高效表達。

背景技術(shù)

植物中50～70％的磷以植酸磷的形勢存在，不能直接被單胃動物所利用，不僅造成磷資源的浪費，同時植酸磷不能被動物利用直接排出體外，造成環(huán)境污染。另外植酸還能與營養(yǎng)物質(zhì)(蛋白質(zhì)、淀粉、礦物元素等)發(fā)生螯合反應(yīng)，影響這些營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和利用。導(dǎo)致植物性飼料營養(yǎng)價值的降低。植酸酶能將植酸分解為肌醇和磷酸，因而植酸的分解和利用，不僅提供了重要的磷源，達到減少磷酸氫鈣的添加和降低磷環(huán)境污染的目的；而且還可消除其抗?fàn)I養(yǎng)作用，提高營養(yǎng)物質(zhì)的消化利用率。植酸的分解主要靠植酸酶來完成，象豬、雞等單胃動物消化道內(nèi)的微生物很少分泌植酸酶，主要靠每天在其日糧中添加植酸酶來實現(xiàn)。一般野生的微生物，象真菌和細菌，其產(chǎn)生的植酸酶量又極低，這極大地影響著植酸酶市場的開發(fā)。隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的應(yīng)用，通過基因工程手段使植酸酶基因在重組菌株中是植酸酶的產(chǎn)量大幅度提高，降低了酶的成本，為植酸酶在畜牧業(yè)生產(chǎn)中的廣泛應(yīng)用提供了前提。

乳酸桿菌是一種非常重要的益生菌，它在維持動物消化道菌群的穩(wěn)定、抑制有害菌生長和促進動物生產(chǎn)方面具有非常重要的作用。面對動物對抗生素產(chǎn)生的耐藥性、抗藥性以及抗生素在畜產(chǎn)品中的殘留問題，目前歐州各國紛紛出臺禁止抗生素作為飼料添加劑在動物飼養(yǎng)中應(yīng)用的法律條文。這些禁令大大地促進了乳酸桿菌替代抗生素在動物抑菌促生產(chǎn)方面的應(yīng)用。

植酸酶作為飼料添加劑存在的問題是每天必須在日糧中添加，這勢必要增加飼養(yǎng)成本。由于目前植酸酶生產(chǎn)的成本高，若不考慮植酸酶減少磷的環(huán)境污染的社會效益，只考慮降低磷酸氫鈣的用量及改善飼料效率和部分促生產(chǎn)性能的經(jīng)濟效益的話，常常會產(chǎn)生利潤低甚至入不敷出現(xiàn)象。從而嚴重地影響了植酸酶添加劑市場，這是目前植酸酶開發(fā)面臨的普遍問題。為了解決這些問題，本研究通過把植酸酶基因轉(zhuǎn)入到乳酸桿菌中，并制成微膠束化顆粒，通過定期混入飼料喂豬，可使該乳酸桿菌長期定居在豬胃腸道，產(chǎn)生足量的植酸酶，以替代每日添加的植酸酶。

我國植酸酶研究雖起步較晚，但發(fā)展迅速，植酸酶的開發(fā)研究被列入到了國家“863”高科技研究計劃。隨著我國植酸酶轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得成功，為我國植酸酶的產(chǎn)業(yè)化市場注入了活力。據(jù)統(tǒng)計我國每年酶制劑市場潛力約10萬噸，價值約20-30億元；而目前銷量還不到十分之一，這主要是由于價格、成本、酶活特性及生產(chǎn)能力等因素限制了酶制劑的應(yīng)用。我國目前的植酸酶面臨的問題同國際市場和其它酶制劑一樣。盡管植酸酶的綜合效益好，但由于環(huán)保效益不被人們關(guān)注，且又無控制污染的標(biāo)準(zhǔn)約束，再加上植酸酶產(chǎn)生的經(jīng)濟效益有限，使許多用戶避用植酸酶，而選用磷酸氫鈣，這主要是由于用戶強調(diào)的只是經(jīng)濟效益。因而，就促使研究人員研制出新的產(chǎn)品，使其在提高經(jīng)濟效益的同時，又達到了保護環(huán)境的目的。轉(zhuǎn)植酸酶基因乳酸桿菌的研制屬國內(nèi)外首次研究和報道，不僅可替代植酸酶添加劑、降低成本、提高經(jīng)濟效益和保護環(huán)境；而且又替代了作為動物飼料添加劑的抗生素，達到維持動物消化道內(nèi)微生物區(qū)系的平衡和抑菌促生產(chǎn)目的。這種具有植酸酶和益生菌雙重功效的轉(zhuǎn)基因乳酸桿菌將具有廣闊的市場前景。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種重組植酸酶基因表達載體及轉(zhuǎn)植酸酶基因乳酸桿菌；

本發(fā)明的另一目的是提供在乳酸桿菌中高效表達植酸酶基因的方法。

本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下：

重組植酸酶基因表達載體，該重組載體為pIAβ8-phyA。

重組植酸酶基因表達載體是由在載體質(zhì)粒pIAβ8上插入基因序列如Ref.EF206311所示的植酸酶基因構(gòu)建的。

轉(zhuǎn)植酸酶基因乳酸桿菌，它是按下述方法構(gòu)建成的：將重組植酸酶基因表達載體pIAβ8-phyA通過電擊轉(zhuǎn)化進入乳酸桿菌中，收獲高效表達植酸酶的轉(zhuǎn)基因乳酸桿菌。

在乳酸桿菌中高效表達植酸酶基因的方法：將重組植酸酶基因表達載體pIAβ8-phyA通過電擊轉(zhuǎn)化進入乳酸桿菌中，收獲高效表達植酸酶的轉(zhuǎn)基因乳酸桿菌。