[發(fā)明專利]一種洋蔥假單胞菌基因工程菌的構建方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200810048124.1
• 申請日: 2008-06-23
• 公開（公告）號: CN101358195A
• 公開（公告）日: 2009-02-04
• 發(fā)明（設計）人: 閆云君;楊江科;劉云;賈彬;徐莉
• 申請（專利權）人: 華中科技大學
• 主分類號: C12N15/52
• 分類號: C12N15/52;C12N15/55;C12N15/56;C12N15/63;C12N15/78;C12N1/21;C12R1/38
• 代理公司: 華中科技大學專利中心
• 代理人: 曹葆青

技術領域

本發(fā)明涉及基因工程技術領域，特別是涉及脂肪酶基因工程菌的構建方法。

背景技術

在能源危機越演越烈的今天，尋找高效、清潔的可再生能源是一項極為重要和迫切的任務，而利用廢棄動、植物油脂轉(zhuǎn)化生產(chǎn)生物柴油無疑是最有效、最直接的辦法。目前生物柴油轉(zhuǎn)化主要有化學法和酶法兩種，其中化學法能耗高、污染大；酶法則具有反應條件溫和、無污染等優(yōu)點，是解決能源危機的有效途徑。

酶法制備生物柴油的工藝中，脂肪酶的成本最高是制約工藝進一步發(fā)展的主要瓶頸之一，不同來源脂肪酶制備生物柴油的效率和得率也不同。研究表明洋蔥假單胞菌脂肪酶在眾多脂肪酶中能夠催化的反應類型最多，反應活性和穩(wěn)定性最高，對酸、堿、短鏈醇等物質(zhì)的耐受性最高(Jaeger?KE，Eggert?T，lipases?for?biotechnology.2002)，是生物柴油制備工藝中最理想的催化酶。然而，洋蔥假單胞菌脂肪酶需要在其本身分子伴侶的幫助下才能正確表達，它的分泌還和胞內(nèi)Dsb復合體等十幾個蛋白質(zhì)有密切關系，由于缺乏相應的表達和分泌機制，洋蔥假單胞菌脂肪酶的異源表達往往沒有活性，即便體外復性，效率和產(chǎn)量也非常低。但是脂肪酶產(chǎn)生菌本身也存在代謝調(diào)控機理不明確、產(chǎn)酶量低、表達不穩(wěn)定等問題。因此只有通過分子生物學手段構建洋蔥假單胞菌脂肪酶同源表達菌株才能從根本上解決上述問題。

T7大腸桿菌表達系統(tǒng)是非常成熟的重組蛋白表達系統(tǒng)，它包括T7RNA聚合酶和一個能被T7RNA酶驅(qū)動的T7啟動子。該系統(tǒng)嚴格依賴T7RNA聚合酶對其特有啟動子T7啟動子的特異選擇性，T7啟動子完全專一受控于T7RNA聚合酶(Tabor?and?Richardson，1985)，而高活性的T7RNA聚合酶合成mRNA的速度比一般RNA聚合酶快5倍，幾乎所有的細胞資源都用于表達目的蛋白。基于T7RNA聚合酶的專一選擇性和優(yōu)越轉(zhuǎn)錄能力，Stidier等人(Studier，Moffatt，1986)首先在大腸桿菌BL21(DE3)中建立起一套受LacUV5啟動子調(diào)控的T7表達系統(tǒng)。該系統(tǒng)在世界范圍內(nèi)得到非常廣泛的應用，成為大腸桿菌中高效表達重組蛋白的首選。Elaine等人(ElaineBrunschwig，Aldis?Darzins，1992)在銅綠假單胞菌中利用lacUV5/laIq構建的T7表達系統(tǒng)也得到普遍應用。此外Barnard等人(Barnard?et?al.，2004)在羅爾斯通氏菌也構建了T7表達系統(tǒng)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種洋蔥假單胞菌基因工程菌的構建方法，得到的基因工程菌具有較高的表達量和催化活力，并且具有較好的低碳醇耐受性以及耐高溫性。

一種洋蔥假單胞菌基因工程菌的構建方法，具體如下：

(1)采用同源重組方法去除洋蔥假單胞菌G63基因組中原有的脂肪酶基因及其伴侶基因，同時導入T7RNA聚合酶基因，獲得能夠表達T7RNA聚合酶的洋蔥假單胞菌重組菌；

(2)將目的基因克隆到含有T7啟動子和LacI阻遏蛋白的表達質(zhì)粒中；

(3)將質(zhì)粒導入洋蔥假單胞菌重組菌，得到洋蔥假單胞菌基因工程菌。

所述步驟(2)中的目的基因為洋蔥假單胞菌脂肪酶及其伴侶基因或者α淀粉酶基因或者纖維素酶基因。

本發(fā)明構建的同源重組菌染色體上原有的脂肪酶及其伴侶基因被T7RNA聚合酶基因替換，因此同源重組菌沒有任何脂肪酶背景，可以方便應用于脂肪酶高通量篩選。而表達載體上位于T7啟動子后的脂肪酶基因也受到LacI阻遏蛋白的負調(diào)控。因此認為，本發(fā)明的洋蔥假單胞菌脂肪酶工程菌是受雙重調(diào)控的良好表達系統(tǒng)。

培養(yǎng)該基因工程菌，在菌種密度達到一定程度時，加入相應的誘導物使脂肪酶基因開始表達并獲得洋蔥假單胞菌脂肪酶。優(yōu)選分批發(fā)酵方法培養(yǎng)該工程菌，發(fā)酵結果顯示工程菌的酶活比原始菌提高4倍以上。

由此可見，本發(fā)明構建的工程菌具有較高的表達量和催化活力，并且具有較好的低碳醇耐受性以及耐高溫性，可以用來大量生產(chǎn)脂肪酶，具有工業(yè)實用性。

附圖說明

圖1為重組菌的生長曲線示意圖。

圖2為基因工程菌的質(zhì)粒穩(wěn)定性曲線示意圖。

具體實施方式

本發(fā)明中的目的基因可以是洋蔥假單胞菌脂肪酶及其伴侶基因，或者α淀粉酶基因或者纖維素酶基因，只要目的基因受T7啟動子調(diào)節(jié)，都可在本發(fā)明構建的洋蔥假單胞菌重組菌中進行高效表達。下面結合實施例對本發(fā)明作詳細說明。

實例1：脂肪酶基因工程菌的構建。