[發(fā)明專利]抗對蝦白斑綜合癥病毒工程蛋白VP28－CD及制備和用途

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200810047776.3
• 申請日: 2008-05-20
• 公開（公告）號: CN101280021A
• 公開（公告）日: 2008-10-08
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 孟小林;徐進平;王健;魯偉;孟海洋;王嵐
• 申請（專利權(quán)）人: 廣西天池海洋生物藥業(yè)有限公司
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/62;C12N1/21;C12N15/70;A61K39/12;A61P31/20;A61K38/17;C12R1/19
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務(wù)所
• 代理人: 王敏鋒

1、一種分離的基因工程融合蛋白，其序列為SEQ?ID?NO.1所示的核苷酸序列。

2、一種分離的基因工程融合蛋白，其序列為SEQ?ID?NO.2所示的氨基酸序列。

3、一種基因工程菌株，其特征在于，該菌株為重組基因工程菌株Escherichia?coliBL21(pET-32a-VP28-CD)，CCTCC?No：M208032。

4、權(quán)利要求3所述的一種基因工程菌株的制備方法，它包括下列步驟：

A.WSSV的VP28基因的制備：首先在冰上取對蝦的鰓、胃和心臟，冰浴勻漿，然后加入蛋白酶K100ug/ml，在沸水中煮15分鐘，冰浴5分鐘，12000rpm離心10分鐘，取其上清置4℃保存，其次是設(shè)計PCR引物，以上述上清作為模板DNA，PCR擴增目的基因VP28，PCR產(chǎn)物通過DNA凝膠電泳檢測，回收PCR產(chǎn)物并將其克隆到pGEM-T載體中，挑取單菌落培養(yǎng)，用堿裂解法提取質(zhì)粒進行酶切鑒定，并進行測序，得到的陽性克隆子即為包含VP28基因的大腸桿菌，為pGEM-T-VP28，用于基因的增殖和保藏；

B.家蠶抗菌肽Cecropin?D成熟肽基因的制備：通過大腸桿菌JM109誘導(dǎo)家蠶，按照RNA提取試劑盒的方法提取其脂肪體總mRNA后，通過RT-PCR得到總cDNA，根據(jù)家蠶抗菌肽Cecropin?D的cDNA序列，設(shè)計并合成引物，以上述得到的總cDNA為模板，PCR擴增得到Cecropin?D基因，PCR產(chǎn)物通過DNA凝膠電泳檢測，回收PCR產(chǎn)物并將其克隆到pUCm-T載體中，挑取單克隆用堿裂解法小量提取質(zhì)粒進行酶切鑒定，并進行測序，根據(jù)Cecropin?D基因的成熟肽序列，去掉信號部分和將C末端的甘氨酸突變成天冬酰胺，并插入酸水解位點Asp-Pro，重新設(shè)計引物，上游引物：AAGCTTGATCCAGGCAACTTCTTCAAGGATCT，下游引物：CTCGAGCTAGTTTTGTCCGAGAGCTTTTGCT，以上述pUCm-T-cecropin?D質(zhì)粒為模板，PCR擴增CD基因，將PCR產(chǎn)物組裝入pGEM-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，挑取單菌落用堿裂解法提取質(zhì)粒進行酶切鑒定，并進行測序，得到的陽性克隆子即為包含CD的大腸桿菌，為pGEM-T-CD，用于基因的增殖和保藏；

C.融合基因的制備及表達載體的構(gòu)建：首先同時雙酶切含CD基因的重組質(zhì)粒和含VP28基因的重組質(zhì)粒，膠回收含CD基因的片段和開環(huán)pGEM-T-VP28片段，4℃連接后轉(zhuǎn)化到感受態(tài)E.coli中，所得到的陽性克隆子命名為pGEM-T-VP28-CD，再同時雙酶切重組質(zhì)粒pGEM-T-VP28-CD和質(zhì)粒pET-32a(+)，膠回收含VP28-CD基因的片段和開環(huán)pET-32a(+)片段，16℃連接后轉(zhuǎn)化到感受態(tài)E.coli中，所得到的陽性克隆子是VP28-CD融合基因的大腸桿菌，為pET-32a(+)-VP28-CD；

D.大腸桿菌基因工程菌的制備：將質(zhì)粒pET-32a(+)-VP28-CD轉(zhuǎn)化到感受態(tài)BL21中，PCR鑒定篩選出陽性轉(zhuǎn)化子，所得陽性克隆即為本發(fā)明涉及的能夠融合表達VP28基因和CD基因的大腸桿菌基因工程菌株。

5、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種基因工程融合蛋白，其特征在于：融合蛋白的分子量為47.95kDa，在VP28和CD之間插入酸水解位點天冬氨酸-脯氨酸Asp-Pro。

6、權(quán)利要求1或2所述的一種基因工程融合蛋白在制備治療或預(yù)防對蝦白斑綜合癥病毒的藥物中的應(yīng)用。