[發(fā)明專(zhuān)利]乙型肝炎病毒表面抗體定量檢測(cè)診斷試劑盒

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200810043550.6
• 申請(qǐng)日: 2008-06-25
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101614738A
• 公開(kāi)（公告）日: 2009-12-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 唐曉燕;陳煌輝;吳馮波
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 上海新波生物技術(shù)有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): G01N33/576
• 分類(lèi)號(hào): G01N33/576;G01N33/569
• 代理公司: 上海浦東良風(fēng)專(zhuān)利代理有限責(zé)任公司
• 代理人: 張勁風(fēng)

技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明涉及一種用于定量檢測(cè)乙型肝炎病毒表面抗體的試劑盒。

背景技術(shù)：

眾所周知，乙肝病毒是嚴(yán)重威脅我國(guó)人民身體健康的病原體微生物之一，人群普遍易感。我國(guó)是乙型肝炎的高發(fā)區(qū)，人群總感染率高達(dá)60％，全國(guó)乙型肝炎表面抗原攜帶者至少有1.2億，其中約10％最終轉(zhuǎn)化為各種慢性肝病，包括慢性肝炎、肝硬化和肝癌。成年人感染HBV后，90％～95％為自限性，5％～10％可成為持續(xù)性感染或慢性化，輸血后乙型肝炎中的50％將慢性化。圍產(chǎn)期及新生兒被HBV感染后，如果沒(méi)有進(jìn)行疫苗阻斷，85％～90％可以成為無(wú)癥狀的HBsAg攜帶者。

普遍認(rèn)為乙型肝炎表面抗體是乙肝病毒的唯一保護(hù)性抗體，它的存在是HBV感染被清除，身體產(chǎn)生對(duì)乙肝病毒免疫力的標(biāo)志。另外，隨著乙肝疫苗的普遍使用，對(duì)于疫苗的使用效果也要由身體是否產(chǎn)生表面抗體來(lái)判斷。因此對(duì)于乙型肝炎表面抗體的檢測(cè)，能夠提示乙肝病情的恢復(fù)和治療情況，判斷注射疫苗后身體對(duì)病毒的免疫情況。

但長(zhǎng)期以來(lái)，國(guó)產(chǎn)的HBV感染標(biāo)志物檢測(cè)試劑一直采用方法學(xué)上比較落后的酶聯(lián)免疫(ELISA)和放射免疫(RIA)分析試劑，更先進(jìn)的發(fā)光免疫檢測(cè)試劑則主要依賴(lài)進(jìn)口；盡管進(jìn)口的發(fā)光免疫檢測(cè)方法在靈敏性、特異性、有效期和測(cè)量范圍方面均有優(yōu)勢(shì)，但其昂貴的價(jià)格卻不易被國(guó)內(nèi)大多數(shù)用戶(hù)所承受。因而市場(chǎng)上急需優(yōu)質(zhì)而價(jià)廉的國(guó)產(chǎn)診斷試劑。

發(fā)明內(nèi)容：

本發(fā)明中縮寫(xiě)的含義：

HBsAg：乙型肝炎表面抗原；抗-HBs：乙型肝炎表面抗體；DTTA-Eu：一種銪離子螯合物N1-(P-異硫氰基芐基)-二乙三胺四乙酸銪鈉；β-NTA：β-萘酰三氟丙酮；Sephacryl?S-200：一種凝膠層析柱填料聚丙烯酰胺葡聚糖S-200；Triton?X-100：壬-(乙二醇)苯辛基醚；TOPO：三辛基氧化膦；Ag：抗原；Ab：抗體，Ab-Eu：銪標(biāo)記抗體。

本法發(fā)明的目的是提供一種操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、特異性好、無(wú)污染的乙型肝炎病毒表面抗體定量檢測(cè)診斷試劑盒。主要解決進(jìn)口發(fā)光免疫檢測(cè)方法成本過(guò)高的技術(shù)問(wèn)題。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明通過(guò)以下方案實(shí)施：

乙型肝炎病毒表面抗體定量檢測(cè)診斷試劑盒，試劑盒由乙型肝炎表面抗體校準(zhǔn)品、純化HBsAg包被反應(yīng)板、銪標(biāo)記純化HBsAg、銪標(biāo)記稀釋液、熒光增強(qiáng)液、濃縮洗液組成。

所述純化HBsAg包被板的制備：將純化HBsAg以磷酸鹽緩沖液稀釋適當(dāng)比例(0.75-6μg/ml)后加入微孔板內(nèi)，100μl每孔，過(guò)夜后洗滌、封閉、干燥，而后將包被板條裝入鋁箔袋內(nèi)，冷藏備用。

所述純化HBsAg銪標(biāo)記物的制備：：將純化HBsAg對(duì)碳酸鹽緩沖液透析后與DTTA-Eu以1∶5的比例混合，靜置18小時(shí)后經(jīng)Sephacryl?S-200分離柱分離DTTA-Eu與Ag-Eu，獲得銪標(biāo)記過(guò)的純化HBsAg。

所述乙型肝炎表面抗體校準(zhǔn)品的制備：以中國(guó)藥品生物制品檢定所國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品2mIU/ml、5mIU/ml、10mIU/ml標(biāo)定抗-HBs羊血清，然后稀釋成含量分別為5mIU/ml、10mIU/ml、40mIU/ml、160mIU/ml、640mIU/ml的校準(zhǔn)品，以1ml/瓶裝量分裝即可。

所述熒光增強(qiáng)液的配制，以無(wú)水乙醇溶解β-NTA、TOPO，再加鄰苯二甲酸氫鉀和三蒸水，40℃溶解后，加入乙酸、Triton?X-100，調(diào)PH值至3.2，并定容。

所述使用方法包括以下乙型肝炎病毒表面抗體測(cè)定步驟：

1.試劑的準(zhǔn)備

(1)洗滌液：將40mL濃縮洗液和960mL去離子水在干凈的洗液瓶中混合，作為工作洗滌液備用。

(2)銪標(biāo)記物：準(zhǔn)確吸取0.3ml去離子水充分溶解標(biāo)記物凍干品，并充分混勻，使用前一小時(shí)內(nèi)用銪標(biāo)記稀釋液按1∶50倍稀釋并一次用完(使用一次性的塑料容器來(lái)配制)。

2.將試劑及所需數(shù)量的微孔反應(yīng)條置室溫(室溫專(zhuān)指20-25℃范圍，下同)平衡。

3.吸取100ul抗-HBs校準(zhǔn)品及待檢樣本，按順序加入微孔反應(yīng)條小孔中并加貼封片。

4.微孔反應(yīng)條在室溫條件下，用振蕩儀緩慢振搖孵育40分鐘。

5.在第一次孵育結(jié)束后，小心將微孔反應(yīng)條上的封片揭下并棄掉，將微孔反應(yīng)條放入洗板機(jī)吸干各孔并每孔注入洗滌液400ul，再吸干各孔，重復(fù)以上洗滌4次，最后一次將微孔反應(yīng)條拍干。

6.每孔中加入100ul銪標(biāo)記物工作液，并加貼封片。

7.微孔反應(yīng)條在室溫條件下，用振蕩儀緩慢振搖孵育40分鐘。